致敬Phillip Sharp和周芷:RNA splicing的發現史

編譯、撰文 | 小白薯

責編 | 兮

我們現在都知道真核生物的大多數基因是不連續的,在從DNA到mRNA的過程中,會先形成pre-mRNA,然後再由剪接體 (spliceosome) 加工成成熟的mRNA,再進行蛋白質的翻譯過程。近些年來,隨著Cryo-EM技術的發展,剪接體的大部分狀態的結構已經得到解析,其催化的分子機制也越來越清晰(詳見BioArt報道:『珍藏版』特別報道丨大師Kiyoshi Nagai的遺作與未竟的「RNA剪接」研究)。然而,在完善這個過程的同時,我們也不能忘記當初發現真核生物「斷裂」基因的這段歷史。2019年底,PNAS刊登了對Phillip Sharp教授(1993年因發現斷裂基因而獲諾貝爾生理學或醫學獎)的人物專訪,介紹了該實驗室當年發現RNA splicing的精彩過程。

下面將全文編譯,與大家共享

下面將全文編譯,與大家共享。

「尾巴」的尋找:DNA剪接的發現

大發現時常隱藏在小細節之中——至少在這篇PNAS的文章中是如此——分子生物學家Phillip Sharp及其研究小組對於一小段RNA的關注和探究,使人們對真核細胞中蛋白質的合成方式有了質的改變【1】

1970年代,Sharp在麻省理工學院(MIT)癌症研究中心做PI。他此前在James Watson實驗室做過博士後,然後在冷泉港實驗室(CSHL)任職,之後被MIT聘用。此時,他正從事的方向是研究基因的本質和測量染色體大小。這在遺傳學領域是相對原創的—Watson和 Francis Crick僅在20年前發現了DNA的結構。

當時的分子生物學家幾乎無一例外地從事細菌系統的研究,因為細菌很容易在實驗室中生長。儘管在加州理工學院 (Caltech) 生化學家Norman Davidson實驗室做博後期間,Sharp主要研究細菌並發表了有關大腸桿菌基因組的研究成果【2,3】,但他還是開始去開拓腫瘤生物學和病毒學方向。當Sharp到達CSHL時,他將注意力轉向了已知會感染動物細胞的DNA病毒。他對人類細胞中的基因表達(將DNA轉化為蛋白質的機制)特別好奇,並開始研究猿猴DNA病毒SV40的轉錄機制。在人類和猴子中都發現,SV40可以產生腫瘤。Sharp對病毒的研究源於與病毒學家Joseph Sambrook的合作。同時,也得益於另一個同事Ulf Pettersson,他致力於研究腺病毒 (Adenovirus) 的DNA複製—Adenovirus是一種具有雙鏈DNA基因組的常見病毒,會在齧齒動物中引起腫瘤並導致人類患多種疾病。

「我和Ulf成為了朋友。」 Sharp說,「他對Adenovirus DNA的複製感興趣;我則對Adenovirus的轉錄活性和基因定位感興趣。」

圖1. MIT癌症研究中心的成員(Robert Weinberg,左下第二排,最左;Susan Berget,下第三排,左三;Claire Moore,後排,左四;Philip Sharp,後排,右 )。圖片由Robert Weinberg提供。

幾年前,微生物學家Daniel Nathans和Hamilton Smith因發現了限制性核酸內切酶【4-6】,並與Werner Arber共同獲得了1978年諾貝爾生理或醫學獎。根據他們的觀點,Sharp開發了一種使用凝膠電泳和溴化乙錠 (EB) 染色純化限制酶的方法。最終,Sharp、Pettersson和其他人一起繪製了Adenovirus 2和5基因組以及其他幾種血清型的限制性圖譜。這些圖譜被廣泛用於鑑定包含致癌基因的病毒區域。

「轉錄方式對於理解病毒是如何產生腫瘤很重要。」 Sharp說,「這也為長期的好奇心奠定了基礎:異質核RNA(heterogeneous nuclear RNA)的重要性。」

當Sharp被MIT Center for Cancer Research招募時,他和博士後Jane Flint擴展了腺病毒的轉錄圖譜。Sharp的另一位同事,分子生物學家Robert Weinberg在五樓的隔壁實驗室裡研究SV40。Adenovirus和SV40均可在被感染的細胞中產生多個複製的基因組,這也使研究分析更加便利。

「Phil Sharp和我,以及其他人研究DNA腫瘤病毒(如腺病毒和SV40)的原因並不是因為我們對癌症本身感興趣,而是因為這些病毒可以為我們複製自己的基因組,」 Weinberg說(他目前是Whitehead生物醫學研究所研究員,也是MIT的生物學教授)實際上,Weinberg補充道,並非中心的所有組都直接關注癌症這一疾病。「MIT Center for Cancer Research是建立在這樣一個觀念上——好奇心驅動的研究就可能會產生巨大的收益(curiosity-driven research is likely to yield great benefits)。」

它做到了。在上世紀七八十年代期間,MIT的Center for Cancer Research是著名科學家的研究中心,其中包括David Baltimore(特別推薦丨David Baltimore的退休時刻)和Susumu Tonegawa,他們分別因發現逆轉錄酶和抗體基因的重組而獲得諾貝爾獎。

在1975年左右,Weinberg為該中心的五樓實驗室組織了組會,以討論他們的研究。Sharp當時幾乎不知道這些會議最終在具有里程碑意義的發現中扮演不可或缺的角色。

1976年,博士後Susan Berget開始使用電子顯微鏡測定細胞質RNA與腺病毒DNA結構之間的關係。Sharp和Berget都與負責癌症中心電鏡設施的技術員Claire Moore密切合作。透過與Sharp的合作,Moore熟悉了一種稱為R-loop分析的技術,該技術當時是在基因組上繪製RNA序列的新方法。透過結合鹽、甲醯胺和熱量創造出一個最佳條件,Moore可以使RNA鏈與其互補DNA雜交

現在為Tufts University的發育、分子和生物化學學教授的Moore說,「您會看到一條細繩(String),並且會出現空泡(Bubble),RNA與DNA雜交置換出另一條鏈。Sharp認為這將是繪製Adenovirus的好方法,因為您可以精確地定位每個基因的位置。」

Adenovirus可高效複製,因此當Berget用它感染人類細胞系時,大多數mRNA分子將來源於病毒。mRNA充當中介模板,將遺傳資訊從DNA傳遞到蛋白質。Berget純化了最豐富的編碼了衣殼蛋白的病毒mRNA,然後給Moore進行雜交實驗,以使其與Adenovirus基因組的特定限制性核酸內切酶片段形成R-loop。使用電鏡觀察得到的R-loop,以及測量的R-loop和雙鏈DNA的長度可以用於確定基因的位置。

「我的任務是準備樣品,」Moore說。「有很多技巧可以使樣品很好地伸展開來。」

製備樣品會用到粘稠的甲醯胺溶液和由玻片製成的坡道。在製備過程中,Moore必須將樣品滴在恰好合適的位置上,以使其擴散到薄膜上。一旦Berget和Moore將制好在薄膜上的樣品收集在一個塗有塑膠的微小網格上,他們便開始對其進行電鏡處理。隨後將該膜插入電鏡並測定可解釋的R-loop結構,然後將其照相。為了獲得準確的測量結果,會對顯微照片進行照相列印。在數十張顯微照片的製作過程中,似乎發現了有些不對勁的地方。

Moore說,「我以前得到的是一個均勻的R-loop,但是在這些R-loop的末端,有些單鏈RNA的小鏈伸出來(圖2),我不知道該怎麼辦。」

圖2.(A–C)Hexon mRNA與Adenovirus基因組片段雜交的電鏡照片。照片中的箭頭標記了RNA/DNA雜交末端的單鏈RNA尾巴。mRNA的5’至3’方向在C圖中表示,細線表示病毒DNA的另一條單鏈。

此前,其他實驗室也發現核內的Adenovirus RNA遠比胞質的mRNA長。研究小組想知道這些長的病毒RNA是否與細胞異質核RNA有關。與Adenovirus RNA相似,這些含有基因序列的核內RNA比細胞質中更穩定的mRNA長得多。

Berget、Moore和Sharp得出的結論是,延伸之一是在轉錄後添加到mRNA末端的Poly A尾巴,沒有鏈可以與他們雜交。他們假設另一條尾巴是偽影,可能是由DNA再雜交和置換RNA引起的,並且進行了無數次實驗驗證。他們消除了另一條DNA鏈,因此沒有別的可以與RNA末端競爭。但是,當RNA與單鏈DNA雜交時,尾巴仍然存在。即使嘗試不同條件的甲醯胺和鹽也無法成功消除延伸的尾巴。儘管如此,Sharp和他的同事們決心在繼續之前排除對尾巴的其他解釋。

「我們第一個不明白的結果是,當我們在顯微鏡下繪製腺病毒mRNA在基因組上的圖譜時,我們在RNA的5’端發現了這條尾巴。」 Sharp說,「它的行為似乎並不像它是緊鄰基因組序列的一部分,我們花了3個月的大部分時間去排除這不是人工產物。」

但是三個月後,經過反覆實驗,多餘的尾巴仍然是個謎。

「直到Sue在一次全樓層的組會上展示資料之前,這還是一個難題,我們認為它可能來自Adenovirus的不同區域,」Moore說。

因此,研究小組嘗試將RNA與更長的DNA雜交。

Moore說,「那時候,‘小尾巴’發現了它的伴侶鏈,並將DNA拉過來形成了新的loop。」

儘管Sharp不確定會期待發生什麼,但他回憶道:「當我看到那幾個loop時,我就知道了它是什麼。」

這就是對異質核RNA之謎的答案。Berget、Moore和Sharp發現了RNA剪接。

在基因轉錄的這個階段,或將DNA資訊轉錄為mRNA的過程,類似於一個句子,因為句子中帶有很多多餘的字母,因此需要對其進行解碼。一旦刪除了使句子看起來像胡言亂語的那些不必要的字母,就會出現清晰的要表達的資訊。在mRNA中,該資訊就是指導蛋白質合成的方向。

人類基因組中估計有成千上萬的基因,它們提供了產生更多蛋白質的指令,而這些蛋白質絕大部分卻是必須透過RNA剪接這一步的。當一個基因被轉錄成RNA中時,它包含一個長而混雜的核苷酸序列,裡面有外顯子和內含子。外顯子透過特定基因的特定指令組成資訊,但平時它們卻被內含子隔開,散佈在pre-RNA中,從而使遺傳資訊難以理解。因此,內含子必須被剪切掉,以便使外顯子可以形成稱為成熟mRNA的連貫資訊鏈—這就是用於在細胞質中合成蛋白質的遺傳密碼。因此,RNA剪接的概念解釋了為什麼核mRNA比細胞質RNA長。

這些RNA剪接的證據是開創性的【1】,該結果1977年在PNAS上發表。

Weinberg說:「有些人非常接近發現剪接,但只是距離近還不夠。您要麼是發現了它,要麼沒有。Sharp做到了。」

在不了解真核RNA剪接之前,大家都有這樣一個共識—所有生物都具有與細菌相同的基因結構—沒有內含子。法國生物化學家Jacques Monod曾獲得1965年諾貝爾生理學或醫學獎,他著名的斷言是,「在大腸桿菌發現的任何真實性也一定對大象具有同樣的真實性【7】。但是,RNA剪接表明,具有不連續基因的真核細胞比細菌要複雜得多。這也揭露了另一個教條的錯誤,即「一個基因產生一個mRNA,而所有來源於同一基因的mRNA產生一種蛋白質」。透過稱為選擇性剪接的過程,只需幾個基因即可產生各種不同的蛋白質。與重新排列一組字母可以形成不同單詞的方式類似,單個基因的外顯子可以重新排序以生成多種蛋白質。

Sharp將發現RNA剪接與發現Rosetta Stone相提並論(18世紀末發現的刻有古埃及國王托勒密五世登基的詔書,印有三種文字,對於古埃及的象形文字研究非常重要)。他的發現為他贏得了1993年諾貝爾生理學或醫學獎。

圖3.(A)Phillip Sharp從瑞典國王卡爾十六世·古斯塔夫(King XVI Gustaf)獲得1993年諾貝爾生理學或醫學獎。(B)Richard Roberts榮獲瑞典國王卡爾十六世·古斯塔夫(Kalf XVI Gustaf)頒發的1993年諾貝爾生理學或醫學獎。

Sharp認為,「RNA剪接為世人所知只是時間問題。總會有人發現他。我們很幸運能做到這一點。」

Sharp仍然是MIT的教授,他對自己40多年前與Berget和Moore一起取得的成就感到敬畏。「有幸成為發現的一部分,它加深了我們的理解和幫助人們的能力,這是一種非同尋常的體驗。」

與Sharp一起獲得諾貝爾獎的分子生物學家Richard J. Roberts【8】,現在為New England Biolabs首席科學家。在CSHL期間,Roberts和他的同事Richard Gelinas將他們的研究重點放在了啟動子上,即從基因開始轉錄成mRNA的DNA區域。他們專門研究了Adenovirus,以確定細菌和真核啟動子是否具有相同的序列特徵。

使Richard J. Roberts獲得諾獎的文章,是獨立地做出了同樣的發現並將結果發表在1977年的Cell上的這篇論文【9】,該文章的第一作者是台灣籍華人周芷(Louise Chow)。

Roberts說,「如果真核基因與細菌基因相同,那就是實驗給我們帶來了不合理的結果。我們想到了用電鏡進行實驗的想法,該實驗將闡明我們一直在進行的所有生物化學實驗結果的疑惑。我們在週六早上設計了該實驗;該實驗是在週二上午由周芷做的,到週二下午,splicing的發現就被大家普遍接受。

(以下是筆者觀點。)

除了這篇論文外,周芷博士還在當年Cell雜誌的前一卷(第11卷,引用9是發表在12卷)上發表了另一篇相關論文【10】,改論文作者分別是Louise T. Chow, James M. Roberts, James B. Lewis和Thomas R. Broker,周芷博士是第一作者,James M. Roberts並不是Richard J. Roberts,因此Richard J. Roberts根本沒出現在作者名單中。當時也沒有通訊作者,自然是第一作者貢獻最大。同為引用9的參考文獻,作者分別是Louise T. Chow, Richard E. Gelinas, Thomas R. Broker和Richard J. Roberts,其中周芷博士依然是第一作者,Richard J. Roberts雖然在最後的位置,但也並非通訊作者,這篇文章也沒有通訊作者,自然也是第一作者的貢獻最大。兩篇重要的參考文獻中,無論怎麼考量也是周芷博士的貢獻最大。

然而,1993年的諾貝爾獎卻沒有頒發給周芷博士,實在是令人疑惑不解。這不得不讓人想到性別歧視和種族歧視。周芷博士為女性,當時身為華人的她雖然已經在美國工作28年,但是依然沒有加入美國國籍。

也有一些其他傳聞,據說當時諾獎委員會誤以為Roberts是實驗室主任,然而,其實那時候CSHL實驗室沒有主任,Roberts自然也不會是;作者list只不過是根據分工不同,按貢獻從前往後排序而已。當然也有人認為,是後來的冷泉港實驗室主任James Watson在推薦的時候只推薦了自己喜歡的Roberts,而沒有推薦周芷博士,使得周芷博士沒有機會獲獎。

不管怎麼說,這中間也反映出當時的一些需要注意的事情,就是作者的貢獻需要在文中清晰列出,現在的文章都會有,然而那時的很多文章都沒有。

事情又過去二十餘年,諾貝爾獎評委也不總是那麼絕對的公平和公正。類似的案例也不是僅此一例。但希望未來能避免此類低級「失誤」,給所有人公平公正的待遇。

對於自己沒有獲獎的訊息,周芷博士自然是表示失望,但是隔天一早還是進實驗室繼續工作。就如她自己的迴應一樣,「這已是難以挽回的事實,只有靜待有心的科學史家去發現真相。

周芷院士簡介:

周芷(Louise T. Chow),1943年出生於湖南,父親周德偉曾是湖南大學經濟系教授,曾任民國時期財政關務署署長,後遷居於台灣接受教育。1965年獲得「台灣大學」農業化學系學士學位。後赴美國求學,在Caltech生物化學系大師Norman Davidson教授門下(可以是說與Sharp師出同門),利用電子顯微鏡研究細菌和噬菌體溶原基因的結構,並於1973獲得博士學位。1973-1975在UCSF醫學院從事博士後研究,1975年加入CSHL研究噬菌體DNA的逆轉錄和腺病毒的轉錄和複製的基因調控。1976年升任為研究員,並發現了真核生物的基因不連續性。1977年升任為高級研究員,1979年升任終身資深科學家。1984年加入羅切斯特大學醫學院,研究人類乳突病毒;1993年加入阿拉巴馬大學醫學院生化系,繼續從事癌症、病毒等方向的研究。2012年,當選美國國家科學院外籍院士(在美國五十多年都沒有加入美國國籍);2014年,當選台灣「中央研究院」院士;2019年5月,受聘為河南大學「傑出人才」特聘教授。

Phillip Sharp教授簡介

Phillip Sharp教授簡介:

Phillip Sharp教授簡介

Phillip Allen Sharp教授,1944年6月6日出生,是美國MIT的遺傳學家和分子生物學家。因發現RNA剪接與Richard J. Roberts共同獲得了1993年諾貝爾生理學或醫學獎。他於1966年獲得Union College學士學位,1969年獲得University of Illinois博士學位。1969-1971年在Caltech從事博士後研究 (Norman Davidson教授門下) ,1971-1974在冷泉港先後擔任博士後和高級研究助理科學家。1974年至今,在MIT先後擔任助理教授、教授,癌症研究所的副主任、主任,生物系主任,McGovern研究所主任等職位。他已獲得無數榮譽,除了諾貝爾獎外,還於1983年先後當選美國科學院和人文與藝術學院院士;1988年獲得Lasker基礎醫學獎;1991年當選美國醫學科學院院士和生理學會會士。此外,他還是多國科學院外籍院士,眾多大學榮譽教授。

製版人:珂

參考文獻

1. S. M. Berget, C. Moore, P. A. Sharp, Spliced segments at the 5′ terminus of adenovirus 2 late mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3171–3175 (1977).

2. P. A. Sharp, M. T. Hsu, E. Otsubo, N. Davidson, Electron microscope heteroduplex studies of sequence relations among plasmids of Escherichia coli. I. Structure of F-prime factors. J. Mol. Biol. 71, 471–497 (1972).

3. P. A. Sharp, S. N. Cohen, N. Davidson, Electron microscope heteroduplex studies of sequence relations among plasmids of Escherichia coli. II. Structure of drug resistance (R) factors and F factors. J. Mol. Biol. 75, 235–255 (1973).

4. K. Danna, D. Nathans, Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68, 2913–2917 (1971).

5. H. O. Smith, K. W. Wilcox, A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J. Mol. Biol. 51, 379–391 (1970).

6. T. J. Kelly, Jr, H. O. Smith, A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. II. J. Mol. Biol. 51, 393–409 (1970).

7. H. C. Friedmann, From 「butyribacterium」 to 「E. coli」: An essay on unity in biochemistry. Perspect. Biol. Med. 47, 47–66 (2004).

8. NobelPrize.org, The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1993/summary/ . Accessed 25 September 2019.

9. L. T. Chow, R. E. Gelinas, T. R. Broker, R. J. Roberts, An amazing sequence arrangement at the 5′ ends of adenovirus 2 messenger RNA. Cell 12, 1–8 (1977). (這篇文章中R. J. Roberts並非通訊作者,只是掛名的四作而已)

10. Louise T. Chow, James M. Roberts, James B. Lewis and Thomas Ft. Broker, A Map of Cytoplasmic RNA Transcripts from Lytic Adenovirus Type 2, Determined by Electron Microscopy of RNA: DNA Hybrids. Cell 11, 819-836 (1977).(這篇文章的作者list中,R. J. Roberts既不是通訊,也不是共一作,而是名字都沒有。其中的二作James M. Roberts與R. J. Roberts並不是同一人;R. J. Roberts僅僅在致謝中出現)。

相關文章