Cell 精讀:UCSD 張瑾團隊首次報道液-液相分離控制cAMP空間區隔和癌症信號通路

細胞內各種不同的生化反應途徑都是由一系列不同的蛋白組成的,執行著不同的生理生化功能。各個信號通路透過中上游蛋白對下游蛋白活性的調節(包括激活或抑制作用),從而改變下游蛋白的立體構象完成信號傳輸。

環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP) 是細胞內重要的第二信使,在信號轉導級聯中發揮著核心作用,調節細胞內許多關鍵的生理和病理生理過程。

在真核生物中,cAMP 的產生通常是透過 G 蛋白偶聯受體 (GPCR) 介導的跨膜腺苷酸環化酶 (ACS) 的激活來響應激素信號而觸發的,後者催化 ATP 合成 cAMP。cAMP 可激活蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA),然後磷酸化各種靶蛋白,從而在基因調控、細胞遷移、細胞增殖、細胞凋亡和線粒體穩態等方面發揮重要作用。因此,當 cAMP 的水平發生波動時,可影響細胞內環境,從而調控細胞功能。

cAMP 信號被效應蛋白所傳導,cAMP 依賴性蛋白激酶 (PKA) 是一種四聚體全酶,由一個調節亞基二聚體與一對催化亞基結合。cAMP 與 PKA 調節亞基結合,釋放 PKA 催化亞基 (PKA cat) 的活性,然後磷酸化細胞內無數的靶點。cAMP 和 PKA 相互協作嚴格控制許多生理過程,從細胞生長和存活乃至機體心臟和神經的多種功能

圖片來源:Cell

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2020 年 8 月 25 日,美國加州大學聖地亞哥分校張瑾教授課題組 Cell 線上發表題為 Phase Separation of a PKA Regulatory Subunit Controls cAMP Compartmentation and Oncogenic Signaling 的文章, 該研究首次發現 cAMP 依賴性蛋白激酶(PKA)的 I 型調控亞基 RIα 在 cAMP 信號作用下進行動態液 – 液相分離能夠形成富含 cAMP 和 PKA 活性的生物分子凝聚物為第二信使 cAMP 的空間區隔化和下游信號傳輸提供精準的控制

由 PKA 的 RIα 亞基形成的 cAMP 生物分子凝聚體 (biomolecular condensates) 控制著局部信號轉導,在這種情況下相分離的中斷能夠使 cAMP/PKA 信號通路紊亂,促進細胞增殖,誘導細胞轉化,從而促進腫瘤的發生

所謂的空間區隔化,這是三十多年前就提出的一種用來解釋不同的 G 蛋白偶聯受體是如何在聚集在無處不在的信使環磷酸腺苷 (cAMP) 的情況下實現特異性的理論

研究結果

細胞內源水平上實現 PKA 調節亞基 RIα 的液 – 液相分離

在多個 PKA 調節亞基中,只有 RIα 是普遍存在且高表達的,它對 PKA 活性的調控是必不可少的。為了觀察 RIα 亞基在細胞水平上的表達動態,該研究透過 CRISPR-Cas9 在 HEK293A 細胞的 RIα C 端引入 GFP 並得到 293-RIα 細胞系。

在新構建的細胞系中觀察到類似於過表達 RIα 的高度動態化熒光斑點;並且令人驚訝的是,經過純化和富集後的 RIα 變成了液滴狀。研究顯示隨著聚乙二醇 (PEG) 濃度的增加,分子擁擠度的增加,也降低了液滴形成所需的 RIα 小分子的濃度;同時增加鹽 (KCl) 濃度則增加了液體液滴形成所需的 RIα 的濃度。在體外和細胞中,發現 RIα 液滴的大小各不相同,內源性 RIα 小斑點只佔整個細胞體積的 0.09% 左右。總之,這部分資料表明 RIα 可形成生物分子凝聚體,並且在內源表達水平能夠產生同樣的效果

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PKAcat (PKA 催化亞基) 抑制 RIα 相分離,cAMP 增強 RIα 相分離

RIα 透過其 N – 末端二聚化和對接 (D/D) 結構域形成專性二聚體,橋接其與 AKAPs (A-kinase anchoring proteins) 的結合,連接 D/D 結構域和 cAMP 結合結構域是一個相對無序的連接區域,它包含一個抑制序列,可作為 PKAcat 的假底物。

為了探測這些域在 RIα 的液 – 液相分離中的作用,該研究了設計了一組帶有 EGFP 標籤的 RIα 突變體,並監測了它們在野生型 HEK293T 細胞中過表達時形成動態化熒光斑點的能力。研究發現缺少 D/D 結構域或接頭區域的突變體未觀察到熒光斑點,而在表達僅包含這兩個區域的突變體的細胞中觀察到熒光斑,說明包含 D/D 域和接頭區域的片段是必要的,在一定程度上對於 RIα 的液 – 液相分離也是足夠的

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當與 cAMP 結合的 RIα 蛋白從 PKAcat 解離時,抑制序列和部分連接區域變得混亂。由於這一區域參與了 RIα 的液 – 液相分離,表明 PKAcat 和 cAMP 可能直接影響這一過程。另一方面,cAMP 在 PKAcat 存在的情況下直接增強 RIα 蛋白群的液 – 液相分離,因為 cAMP 的加入在體外減弱了 PKAcat 對 RIα 蛋白群小液滴形成的抑制作用,並允許低 RIα 蛋白群濃度下的小液滴形成在表達 GFP1-10 的 293-RI 型細胞中,用 AC 激活劑 Forskolin (Fsk) 刺激 cAMP 升高可導致內源性 RIα 型斑點狀細胞的急性增加。

此外,透過腎上腺素能受體激動劑異丙腎上腺素增加 cAMP 水平可瞬時增加每個細胞內源性 RIα 熒光斑點的數量,這與 GPCR 激動劑誘導的 cAMP 的效果一致。這些資料表明,當 cAMP 結合的 RI 與 PKAcat 分離時,其抑制序列和連接區域的紊亂增加,而 cAMP 結合的 RIα 更容易發生 LLPS。與此觀察結果一致的是,PKAcat 在體外與 RIα 抑制劑和 cAMP 混合時形成液滴,但其自身不形成液滴。這些結果提示,cAMP 動力學決定了 RIα 相分離體的形成和溶解,PKAcat 與 RIα 能夠共相分離

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RIα 在 cAMP 信號作用下形成生物凝聚體,為 cAMP 的空間區隔化提供精準調控

在此部分研究中,該團隊設計了針對內源性蛋白質的一種基於熒光共振能量轉移 (FRET) 的熒光傳感器 (FluoSTEPs),透過對 RIα 熒光斑點形成期間 PKA 活性和 cAMP 動態的變化的監測,研究發現在表達 PKA 催化亞基的 293-RIα 細胞中,Forskolin (Fsk) 誘導熒光斑點的形成;同時,在新形成的 RIα 熒光斑點中,Fsk 誘導的 FluoSTEP-ICUE 反應較大。

鑑於在 RIα 的生物分子凝聚體中觀察到的高水平 cAMP,該研究假設這些物質透過充當一個動態緩衝系統來幫助 cAMP 的區隔化。用一種改進的 cAMP 傳感器(ICUE4)融合到 PDE4D2(PDE4D2cat)的催化部分來監測 PDE 室中的 cAMP 含量,作為 cAMP 區隔化的直接分析方法,研究發現 Fsk 使標準化的青色 / 黃色發射比僅增加了 6.2%,而用 PDE4 選擇性抑制劑 rolipram 和一種通用 PDE 抑制劑 3 – 異丁基 – 1 – 甲基黃嘌呤(IBMX)則完全阻斷 PDE 活性,也就是說 PDE4D2cat 在信號調控過程中條件下,當空間區隔化調控系統完好時,可以形成一個 cAMP 區隔流

此外,使用染料標記的 cAMP 的實驗表明,cAMP 本質上是「被困」在 RIα 生物分子凝聚體中。總的來說,這些結果突出了 cAMP 區隔化的關鍵機制,不足 1% 細胞體積的 RIα 液滴,可以招募大約 99% 的細胞內 cAMP,確保其在細胞內 cAMP 信號特異性

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RIα 相分離的中斷破壞 cAMP 的區隔化,導致細胞增殖和轉化程度增加

鑑於 RIα 的液 – 液相分離對於實現 cAMP 分隔至關重要,該研究預測 DnaJB1-PKAcat 誘導的 RIα 的液 – 液相分離失調將導致 cAMP 區隔化發生缺陷並造成紊亂。研究採用 PDE4D2cat-ICUE4 cAMP 區隔化測試了 DnaJB1-PKAcat 的效果

研究發現,在表達野生型 PKAcat 和 RIα 的細胞中,當 RIα 的液 – 液相分離受到干擾時,在相同的條件下,Fsk 不會引起 PDE4D2cat-ICUE4 的藍綠色 / 黃色發射比的可檢測變化,但是會導致藍綠色 / 黃色發射比的大幅增加。廣泛存在的 DnaJB1-PKA 融合蛋白的確會破壞細胞內 RIα 的液 – 液相分離,進而使得 cAMP/PKA 信號通路失調。也就是說 DnaJB1-PKAcat 對 RIα 的液 – 液相分離的破壞顯著損害了 cAMP 的區隔化,為癌蛋白融合引起的異常信號傳導提供了機制線索

為了測試缺失 RIα 的液 – 液相分離功能的後果,研究使用非致瘤性肝細胞 AML12,在該細胞系中穩定表達了野生型或各種突變型的 RIα,透過測量它們的增殖率和轉化能力,研究發現與野生型細胞相比,缺失 RIα 可使細胞增殖和 DNA 合成增加 2 倍。在 RIα 缺失細胞中,重新表達野生型 RIα 可以挽救野生型的表型,而穩定表達液 – 液相分離或 cAMP 結合缺陷的 RIα 突變體不能挽救野生型表型。RIα 的液 – 液相分離的缺失和 cAMP 區隔化的破壞導致肝細胞的致瘤表型,在小鼠胚胎成纖維細胞中也觀察到類似的結果,表明 RIα 的液 – 液相分離的抑瘤特性具有廣泛的意義這一發現揭示了 FLC 可能的發生機理,以及不受控的 cAMP 導致癌症發生的可能機制

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研究總結:

綜上所述,該研究發現了一種無膜細胞器結構它參與調控 PKA 信號通路,所取得的研究結果代表了在理解 cAMP/PKA 途徑如何動態協調信號轉導的概念性飛躍,並發現了 cAMP/PKA 信號轉導失調與癌症發生之間的聯繫

總的來說,該研究展示了信號調控的複雜性以及生物分子凝聚體對小分子第二信使的空間區隔作用,凸顯其在信號調控中的重要性

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參考文獻:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.043

題圖來源:站酷海洛 Plus

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