新冠疫情下，常態化核酸檢測已經成為日常生活的新常態。快速、即時的核酸檢測是遏制新冠疫情傳播的強大武器。RT-PCR 是當下新冠檢測的「金標準」 ，但需要大量勞動力和設備基礎設施進行樣本採集、核酸提取、熱循環和資料分析，整體檢測流程較長。因此，開發一種無需複雜儀器、快速診斷的檢測技術至關重要。
2022 年 8 月 11 日，加州大學柏克萊分校Jennifer Doudna（2020 年的諾貝爾化學獎得主之一）、David Savage和Patrick Hsu三位科學家領導的研究團隊，在Nature Biomedical Engineering上發表了題為Rapid detection of SARS-CoV-2 RNA in saliva via Cas13的研究性論文，報告了一種高敏感性和高特異性的快速檢測新冠病毒的方法——DISCoVER，無需提取 RNA，就可以檢測出唾液中的 SARS-CoV-2。
圖片來源：Nature Biomedical Engineering
研究內容
首先，研究者試圖比較 Cas13 和 Cas12 酶的核酸檢測特性，評估了Leptotrichia buccalisCas13a（LbuCas13a）和Lachnospiraceaebacterium ND2006 Cas12a（LbCas12a）的報告酶切割活性，並在其相應的合成活化劑分子稀釋系列中，使用匹配的引導 RNA 間隔序列。結果顯示LbuCas13a 在低活化劑濃度下的檢測速度明顯快於 LbCas12a。
為了達到更高的靈敏度，研究者選擇了環介導等溫擴增技術（LAMP）作為一種經濟高效的核酸擴增方法。LAMP 使用逆轉錄酶、鏈置換 DNA 聚合酶和三組引物，將病毒 RNA 轉化為 DNA 底物。
由於 Cas13 靶向單鏈 RNA，而 LAMP 擴增 DNA 底物，研究者採用了 LAMP 產物的轉錄來實現底物的兼容性。將 T7 RNA 聚合酶啟動子序列整合到 LAMP 引物序列，用於後續的轉錄和 Cas13 檢測，研究者將此稱為 rLAMP。經測試，T7 啟動子在 rLAMP 擴增子中正確摻入併發揮作用。
圖片來源：Nature Biomedical Engineering
為了確認 DISCoVER 檢測方法的可複製性，研究者在 8 個 mBIP rLAMP 反應重複中測試了 Cas13 檢測，其中 RNA 在 20 μl 反應體系中的濃度為 100 複製/μl。所進行的八次重複中陽性樣本信號均是陰性對照的 25 倍以上，保持很好的穩定性。
接下來，研究者試圖確定 DISCoVER 對唾液樣本的分析靈敏度和特異性。對一系列病毒濃度進行了 20 次 DISCoVER 重複檢測後，確定了唾液中病毒檢測的最低濃度為 40 複製/μl。為了測定 DISCoVER 的特異性，對來自 30 個 SARS-CoV-2 陰性的不同個體的唾液樣本進行了測試，沒有出現任何假陽性信號。
圖片來源：Nature Biomedical Engineering
接下來，研究者中使用 DISCoVER 驗證了從患者呼吸道拭子樣本中提取的總 RNA。結果顯示，DISCoVER 對提取的 RNA 的敏感性為 93.9%，特異性為 100%。此外，研究者觀察到 PPV 為 100%，NPV 為 93.75%。
最後，研究者開發了一種緊湊型行動式微流體設備，可在即時護理應用的環境中進行檢測。該化學反應適用於在重力驅動的微流控盒上運行，具有溫度控制的反應和檢測室。該裝置包含用於控制流體流動的排氣泵、用於 rLAMP 室的電阻加熱器和用於 Cas13 室冷卻和加熱的熱電冷卻器/加熱器（TEC）。測定熒光檢測由緊湊型定製檢測器進行，用於實時樣品讀數。
圖片來源：Nature Biomedical Engineering
研究者對 DISCoVER 設備進行了實驗驗證。重新測試了三個陰性和三個陽性呼吸道臨床樣本。在所有三個陽性樣本中均正確檢測到了 SARS-CoV-2，並且在所有三個陰性樣本中僅檢測到 RNase P 信號。然後，研究者對 10 個經 RT-qPCR 檢測為 COVID-19 陽性的現場收集的臨床唾液樣本和 3 個陰性唾液樣本進行了檢測，進一步驗證了該設備的穩健性和可重複性。
總結
本研究開發了一種新的 SARS-CoV-2 檢測方法——DISCoVER 檢測，建立了不需要提取 RNA 的檢測流程，可以對唾液中的 SARS-CoV-2 進行檢測。DISCoVER 檢測結合了 30 分鐘的 rLAMP 步驟，然後是 T7 轉錄和基於 Cas13 的檢測，靈敏度和特異性極高，實現了快速檢測。敏感的核酸擴增與 CRISPR 介導的特異性和可程式設計性相結合，有可能為多種病原體檢測提供靈活的診斷。
與咽拭子或鼻拭子樣本相比，唾液樣本的採集更具舒適性。同時，唾液採集可能不需要醫務人員進行，因此更能節約樣品採集所需的人力，也使得該研究成果更具有應用推廣的價值。
拓展閱讀
全球新冠疫情此起彼伏，科學家們也馬不停蹄，努力研發提高新冠檢測能力和靈敏度的方法，基於 CRISPR 的新冠檢測方法近年來也層出不窮。
2020 年 4 月 8 日，麻省理工的「CRISPR 之父」張鋒團隊提出了使用環介導等溫擴增測序（Loop-mediated isothermal amplification-seq, LAMP-Seq）結合 DNA 條形碼標記，和高通量測序結合能使用單儀器在 14 小時內完成 10 萬人的診斷，以實現新冠病毒大規模診斷的可能。
2020 年 5 月，生物技術診斷公司 Sherlock Biosciences（由張鋒等人創立）的新冠診斷試劑盒獲得了美國食品藥物監督管理局（FDA）的緊急使用授權。
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2020 年 4 月 17 日，來自美國加州大學舊金山分校的研究團隊，開發出的一種低成本拭子檢測方法，可在 40 分鐘內診斷新冠病毒感染。新檢測的開發是基於 CRISPR-Cas12 的側向流動檢測技術，不需要專門的設備，在任何實驗室都可進行。這與需要專門設備進行檢測的 PCR 相比，確實更加方便，但其敏感度也確實比 PCR 檢測稍低。
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2021 年 8 月 5 日，加州大學柏克萊分校Jennifer Doudna、David Savage和Patrick Hsu三位科學家領導的研究團隊，結合了兩種不同的 CRISPR 酶，創造了一種能在一小時內檢測到少量病毒 RNA 的方法，這種被稱之為快速串聯集成核酸酶檢測（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT）的無擴增技術，可以為許多傳染病及當前流行的 COVID-19 提供快速且廉價的診斷策略。
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題圖來源：站酷海洛
參考文獻：
[1] Agrawal, Shreeya, Alison Fanton, Sita S. Chandrasekaran, Noam Prywes, Maria Lukarska, Scott B. Biering, Dylan CJ Smock et al. “Rapid detection of SARS-CoV-2 with Cas13.” medRxiv (2020).
[2] Schmid-Burgk, Jonathan L., Ricarda M. Schmithausen, David Li, Ronja Hollstein, Amir Ben-Shmuel, Ofir Israeli, Shay Weiss et al. “LAMP-Seq: population-scale COVID-19 diagnostics using combinatorial barcoding.” biorxiv (2020).
[3] Broughton, James P., Xianding Deng, Guixia Yu, Clare L. Fasching, Venice Servellita, Jasmeet Singh, Xin Miao et al. “CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2.” Nature biotechnology 38, no. 7 (2020): 870-874.
[4] Liu, Tina Y., Gavin J. Knott, Dylan CJ Smock, John J. Desmarais, Sungmin Son, Abdul Bhuiya, Shrutee Jakhanwal et al. “Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases.” Nature chemical biology 17, no. 9 (2021): 982-988.
