撰文 | Victoria
責編 | 兮
快速的興奮性突觸傳遞是大腦發育以及學習記憶等高級腦功能的基本要素，穀氨酸受體包括N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA受體，即NMDARs）介導的興奮性神經傳遞對正常大腦的發育和功能，多種神經疾病包括阿爾茨海默病、抑鬱症、中風、癲癇、精神分裂症等，甚至對腫瘤生長和腦轉移都至關重要。NMDARs是由GluN1和GluN2亞基組成的異四聚體，它們分別結合甘氨酸和穀氨酸，以激活離子通道。儘管NMDARs在腦生理學中很重要，但激動劑和拮抗劑的亞基特異性結合導致激活和抑制的確切機制仍然未知。
NMDARs在配體結合結構域（LBD）上結合激動劑和競爭性拮抗劑，而許多變構調節劑在氨基末端結構域（ATD）或LBD上結合以調節離子通道跨膜結構域（TMD）的打開和關閉（圖1）。Hiro Furukawa將超大NMDAR分為多個區域，採取各個擊破的策略，從而解析其三維結構，從2003年和2005年Hiro Furukawa的兩篇重磅文章對ATD和LBD結構的研究開始，Hiro一致深耕於NMDARs結構的研究（期間重要成果梳理見「參考文獻」），在理解NMDARs的功能方面做出了重要貢獻。
圖1. NMDARs結構域的組成
近日，NMDARs結構和功能研究領域資深科學家、冷泉港實驗室Hiro Furukawa團隊在Cell雜誌上發表題為Structural Basis of Functional Transitions in Mammalian NMDA Receptors的研究論文，這項研究透過提供在4Å或更高的不同配體狀態下的多個結構，展示了構象變化和導致激動劑門控和亞基依賴性競爭抑制的構象變化以及亞基/結構域間重新定向的詳細模式。這些結構表明GluN1和GluN2拮抗劑透過控制配體結合區和GluN2亞基跨膜離子通道之間linker的張力而激活和競爭性抑制。這種處於不同配體狀態的多個結構為NMDAR藥理學、激活和抑制的機制帶來了很多啟發，這些都對大腦生理學至關重要（圖2）。
圖2. 文章思路總覽
亞基間/結構域重排是NMDARs功能轉換的關鍵，因此，準確監測GluN1-GluN2異四聚體多結構域的構象變化對於理解其機理和新試劑的開發至關重要。儘管目前在中低解析度結構中（~5–15 Å）已觀察到了ATD和LBD之間的一些蛋白質構象變化模式，但是它們如何控制TMD通道還未知，TMD和LBD-TMD linker的密度仍未被解析，重要的是，目前還不清楚GluN1-和GluN2B特異性競爭性拮抗劑是如何在另一個亞基被激動劑佔據時抑制通道活性的。
因此，儘管NMDAR結構生物學有了進展，但導致通道激活和抑制的機制仍然難以捉摸。為了克服這一問題，作者改進了樣品製備方法，以獲得GluN1b-GluN2B NMDARs的冷凍電鏡結構，其總解析度為4Å或更高，分辨了處於不同狀態的GluN1b-GluN2B NMDAR的結構。
首先，作者發現在激動劑結合後，NMDAR形成了三種主要的構象狀態，命名為「Non-active1」、「Non-active2」和「Active」，它們在GluN1b-GluN2B和ATD-LBD間的取向模式上有所不同。作者透過對這幾種狀態的分析證明了NMDAR的門控機制是不同的。激動劑結合「伸展」了 GluN2B LBD-TMD linkers以干擾通道門。然而，「Non-active1」或「Non-active2」構象是否代表具有封閉通道的脫敏狀態或非脫敏狀態，目前仍是一個懸而未決的問題。
接下來，作者對「Active-SS」結構的研究表明，這個插入位點是在GluN2B LBD-M30 linker末端的GluN2B螺旋E0的中間。因此，它可能會以一種非常有趣的方式使螺旋E0區域的結構變形，「放鬆」了GluN2B LBD-M30 linkers的張力。作者透過獲得兩種激動劑/拮抗劑組合Gly/SDZ和L689/Glu的冷凍電鏡結構，證明GluN1和GluN2拮抗劑透過「放鬆」GluN2B LBD-M30 linker來抑制受體激活。
在這兩種結構中，拮抗劑的結合穩定了LBD的開放裂縫構象（圖3）。在Gly/SDZ複合物中，GluN1b-GluN2B-LBD異二聚體的排列類似於「Active -SS」狀態，其中GluN1b-GluN2B-LBD異二聚體被「捲起」，GluN1b-GluN2B-ATDs的R2彼此接近。與激動劑結合的「Active-SS」狀態不同，SDZ-220-040的結合打開GluN2B-LBD-bi-lobe，進而鬆弛了GluN2B-LBD-M30 linker，有利於關閉通道門。在相反的情況下，當GluN1拮抗劑、L689,560和穀氨酸結合形成L689/Glu時，異二聚體 「向下滾動」，GluN2B LBD-M30 linker由於受體進入「Non-active1」樣構象而變得「鬆弛」。
最後，作者證明GluN1-和GluN2靶向拮抗劑（L689/SDZ）的結合透過以類似於「Gly/SDZ」複合物的方式打開GluN2B-LBD雙葉，從而放鬆GluN2B-LBD-M30 linker。
圖3. 構象轉換示意圖
這項研究表明，ATDs和LBDs之間的緊密耦合在結合LBDs的配體的激活和競爭抑制中起著關鍵作用。有趣的是，針對NMDAR的自身免疫抗體包括狼瘡中產生的抗體和抗NMDAR腦炎抗體結合ATD，可改變離子通道功能，進一步表明ATD，LBD和TMD之間的緊密耦合。另一方面，設計用於控制在本研究中觀察到的構象轉變平衡的試劑在NMDAR功能相關疾病治療中也很有意義。
這項研究確定了哺乳動物NMDA受體功能轉變的結構基礎，揭示了先前研究中看不到的結構特徵，包括LBD-TMD連接區、通道門和配體密度，為NMDARs結構解析帶來了精確和詳細的資訊。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.052
製版人：十一
參考文獻
1. Furukawa, H., and Gouaux, E. (2003). Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22, 2873–2885.
2. Furukawa, H., Singh, S.K., Mancusso, R., and Gouaux, E. (2005). Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature 438, 185–192.
3. Karakas, E., Simorowski, N., and Furukawa, H. (2009). Structure of the zinc- bound amino-terminal domain of the NMDA receptor NR2B subunit. EMBO J. 28, 3910–3920.
4. Karakas, E., Simorowski, N., and Furukawa, H. (2011). Subunit arrangement and phenylethanolamine binding in GluN1/GluN2B NMDA receptors. Nature 475, 249–253.
5. Vance, K.M., Simorowski, N., Traynelis, S.F., and Furukawa, H. (2011). Ligand- specific deactivation time course of GluN1/GluN2D NMDA receptors. Nat. Commun. 2, 294.
6. Jespersen, A., Tajima, N., Fernandez-Cuervo, G., Garnier-Amblard, E.C., and Furukawa, H. (2014). Structural insights into competitive antagonism in NMDA receptors. Neuron 81, 366–378.
7. Karakas, E., and Furukawa, H. (2014). Crystal structure of a heterotetrameric NMDA receptor ion channel. Science 344, 992–997.
8. Karakas, E., Regan, M.C., and Furukawa, H. (2015). Emerging structural in- sights into the function of ionotropic glutamate receptors. Trends Biochem. Sci.40, 328–337.
9. Romero-Hernandez, A., Simorowski, N., Karakas, E., and Furukawa, H. (2016). Molecular Basis for Subtype Specificity and High-Affinity Zinc Inhibition in the GluN1-GluN2A NMDA Receptor Amino-Terminal Domain. Neuron 92, 1324–1336.
10. Tajima, N., Karakas, E., Grant, T., Simorowski, N., Diaz-Avalos, R., Grigorieff, N., and Furukawa, H. (2016). Activation of NMDA receptors and the mecha- nism of inhibition by ifenprodil. Nature 534, 63–68.
11. Regan, M.C., Grant, T., McDaniel, M.J., Karakas, E., Zhang, J., Traynelis, S.F., Grigorieff, N., and Furukawa, H. (2018). Structural Mechanism of Functional Modulation by Gene Splicing in NMDA Receptors. Neuron 98, 521–529.
12. Regan, M.C., Zhu, Z., Yuan, H., Myers, S.J., Menaldino, D.S., Tahirovic, Y.A., Liotta, D.C., Traynelis, S.F., and Furukawa, H. (2019). Structural elements of a pH-sensitive inhibitor binding site in NMDA receptors. Nat. Commun. 10, 321.
