張鋒團隊再獲新進展!Nature 發文解析「超迷你」核酸酶 IsrB 結構及 DNA 切割機制

科學界一直致力於使 CRISPR 基因編輯工具小型化以適應如腺病毒相關病毒(AAV)的遞送載體。然而,通過結構引導或定向進化使 RNA 引導核酸酶小型化的嘗試都不是特別成功。因此,科學家把目光投向了自然界中未被開發的小型基因編輯工具

在張鋒團隊 2021 年發表的Science論文中,發現了一類廣泛存在的由 IS200/605 轉座子超家族編碼的核酸酶(包括 IscB,TnpB 和 IsrB),統稱為OMEGA 系統(Obligate Mobile Element Guided Activity),這些核酸酶的體積約為 Cas9 大小的 30%,具有極大的改造潛力。

圖片來源

圖片來源:Science

2022 年 10 月 12 日,張鋒實驗室繼續在Nature期刊發表了題為Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA的研究論文,分析了脫硫弧菌 DtIsrB-ωRNA 和靶 DNA 的複合物的冷凍電鏡結構(解析度 3.1 Å)及 DNA 靶向切割的分子機制,為下一步對 IsrB 的開發和改造提供了理論基礎

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圖片來源:Nature

像 IscB 和 Cas9 一樣,IsrB 含有一個 RuvC 樣核酸酶結構域,該結構域被橋螺旋結構截斷。IsrB 長度僅有約 350 個氨基酸,相比 IscB(Cas9 的祖先)缺少 HNH 核酸酶結構域,同時也缺失 Cas9 的 REC lobe(參與靶標識別)和 PAM 序列互作域。作者推測 IsrB 通過 ωRNA 形成的複雜的三元結構來彌補 REC 的作用。

IsrB 還含有一個 N 端 PLMP 結構域(以其保守的氨基酸基序命名)和一個未表徵的 C 端結構域。PLMP 結構域具有四鏈反平行 β 片和 α 螺旋結構,其結構類似於翻譯起始因子 3(IF-3)的 N 端結構域。TAM 相互作用結構域和 RuvC 結構域協同定義了 IsrB 的活性位點。

圖:IsrB-ωRNA-靶 DNA 複合物的低溫電鏡結構(來源:Nature

OMEGA 使用 ωRNA 作為引導來指導 DNA 的直接切割。這些轉座子移動時會產生新的引導 RNA,允許酶在其他地方切割 DNA。IsrB 與 300-nt ωRNA 相關聯,其指導 IsrB 切割含有 5′-NTGA-3′ 相鄰基序(TAM)的雙鏈 DNA。

DtIrsB ωRNA 結構模型(來源:Nature

ωRNA 驅動異源雙鏈識別:上層與下層 RNA 螺旋相互作用,並廣泛地與切口模組(PLMP/RuvC/TI 結構域)通過 S2,SL4 和 SL7 間的銜接子假結相互作用。PLMP 結構域與 ωRNA 3′端附近的串聯髮夾(SL7 和 SL8)相互作用。截短 SL7/8 而不截短 SL8 降低了 IsrB 的切口活性。

作者推測,ωRNA 結構基序對 ωRNA/RECL 的 DNA 感應別構調節和 RuvC 核酸酶結構域的 DNA 切割活性是重要的。

DtIsrB 通過氫鍵和範德華力相互作用的組合識別非靶鏈中的 TTGA 靶標相鄰基序(TAM),改變這些相互作用可以擴展 TAM 偏好。編碼導向銜接子區域(RNA 的 5′-莖區)對細菌基因組中的 IS200/IS605 轉座子活性是重要的,但不是 IsrB 切割靶 DNA 所必需的。作者截短了這個區域的 SL1(ΔSL1ωRNA),發現所得的 RNA 仍然支持 IsrB 的 DNA 切割活性。

IsrB 的 DNA 靶向性和切割機制(來源:Nature

為了追蹤從 IsrB 到 Cas9 的蛋白質結構域進化,作者比較了 IsrB 的結構與已知最大 IscB 和 Cas9 的結構。

除了在 IscB 中包含 IsrB 缺失的 HNH 結構域,作者還觀察到其他區域的差異:一些 IscB 的 RECL 比 IsrB 中的相應接頭區域大,並摺疊成最小的二級結構,而 Cas9-1 的 REC 區域中存在大的球狀結構域。OgeuIscB 中的 RuvC 結構域包含幾個較大的環,而在 YnpsCas9-1 的 RuvC 包含長的插入及高度結構化的結構域。Cas9 RuvC 結構域的擴大伴隨著 PLMP 結構域的丟失。

SpCas9 包含一個更大的 PAM 相互作用域,其中包含一個位於公共核心 PAM 相互作用域下游的額外球狀區域。在 Cas9 中 ωRNA 減小並分裂成雙 RNA (如 tracrRNA-crRNA),伴隨著 REC 結構域的獲得和 Cas9 的所有結構域的整體擴大。

在下圖中,祖先 RuvC 核酸酶向 IsrB 和 Cas9 進化的結構決定因素以彩色顯示。其中,Cas9 取代 DtIsrB ωRNA 中 SL2 的 REC2 部分(深灰色部分)。

IsrB 進化模型(來源

IsrB 進化模型(來源:Nature

值得一提的是,美國康奈爾大學可愛龍團隊於 2022 年 5 月在Science發表了一篇文章,其中解析了 IscB-ωRNA 的結構及其切割 DNA 的機制。

圖片來源

圖片來源:Science

這些新系統將幫助我們了解 RNA 引導系統是如何起源進化的,併為開發更多種類的可程式設計工具鋪平道路。

論文連結:

1. https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856

2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05324-6

3. https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7220

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