近年來，隨著生物醫學的蓬勃發展以及對疾病發生機理認識的不斷深入，微生物組對人體健康的重要性也逐漸受到科學家們的重視。
人體內的微生物總量高達千億，涵蓋種類超過 1000 種，它們在包括癌症，代謝性疾病，心腦血管疾病，神經系統疾病等眾多疾病的發生過程中起著十分重要的作用。
然而，由於其複雜的生物學特性以及相關技術手段的侷限，目前很多研究結論並不明確，質量也難以得到保證。大家可能聽到過這樣的說法：「遇事不決，量子力學；通路難尋，腸道菌群」。將「腸道菌群」與「量子力學」並稱兩大「玄學」，雖說是一種調侃，但也一定程度上反映了業內人士對這一新興學科的複雜態度。
不同於傳統生物學，微生物組相關研究需要我們同時掌握對微生物領域以及宿主免疫，代謝等領域的充分了解。在此基礎上，尋找合適的問題以及開發合理的技術手段也必不可少。對此 Science 雜誌刊登了三位入圍首次「NOSTER & Science Microbiome Prize」最終決選的青年科學家的科研心得。透過對比他們提出科學問題的獨特角度以及課題設計思路，或許能夠幫助我們矯正在以往研究中可能存在的問題。
丁香學術為大家分享來自 Weill Cornell 醫學院的助理教授郭春君，範德比爾特大學助理教授 Mariana X. Byndloss 以及 西雅圖 Benaroya 研究所的助理研究員 Oliver Harrison 在微生物組與人類健康領域的研究成果，以及三位青年學者對這一新興領域的獨到見解 1-3。
(NOSTER& Science Microbiome Prize, www.sciencemag.org)
1. 腸道菌群 ——「健康管理者」
1.1 關於 Mariana X. Byndloss 博士
Mariana X. Byndloss在加州大學戴維斯分校經歷了為期數年的博士後訓練之後，2018 年加入範德比爾特大學開展獨立研究工作。她的研究旨在了解炎症引發的腸道上皮細胞代謝變化如何導致腸道營養不良以及鼠傷寒沙門氏菌和非傳染性疾病（即肥胖相關的心血管疾病和結腸癌）如何導致傳染性胃腸炎的風險增加。
（Mariana X. Byndloss 博士，www.sciencemag.org）
1.2 調節宿主代謝 —— 腸道厭氧型共生菌的生存策略
人體腸道與共生菌群共同組成了一個複雜的生態系統，其中大部分由厭氧型細菌構成。很多研究表明，腸道微生物及其代謝產物可透過多種機制影響人類健康，包括改變免疫應答，改變宿主細胞代謝狀態，甚至影響對免疫療法的應答。
在健康的結腸中，兼性厭氧型腸桿菌科細菌並不佔據主要地位，然而，在眾多腸道相關疾病發生過程中，均出現了以腸桿菌科細菌大量擴增為代表的腸道菌群紊亂症狀。一方面，臨床上使用口服抗生素會是導致腸桿菌異常繁殖的主要原因，而另一方面，很多患有嚴重腸炎，腸易激綜合徵以及腸癌的患者腸道內也存在腸桿菌的過量生長。
這些研究結果表明腸桿菌科細菌的生長可能在上述人類疾病的發病過程中起重要作用，應該被認為是腸道健康狀況不佳的微生物特徵。
由於在微生物學，免疫學和獸醫學方面均具有深厚的專業背景，Byndloss 博士致力於深入探究宿主與腸道菌群相互作用的機制，從而防止腸桿菌的繁殖與疾病的發生。
專性厭氧型細菌總體而言對機體健康具有益處，它們透過將飲食中複雜的碳水化合物發酵降解，從而為宿主提供能量與營養；相反，以腸桿菌為代表的兼性厭氧型細菌則沒有上述益處。不僅如此，在有氧氣存在的情況下，腸桿菌還會代謝發酵產物將營養物質從宿主體內排出。在長時間的進化過程中，宿主已經發展出了某種策略：透過在腸道中營造高度缺氧的環境，從而有利於厭氧型細菌的生存以及種群穩態的維持。這一策略可以被稱為「腸道菌群滋養免疫力」12。
在最近的研究中，Byndloss 博士揭示了結腸上皮細胞在促進益生菌群和「腸道菌群滋養免疫力」形成方面的核心作用。結腸細胞的成熟和分化需要核受體 PPAR-γ 蛋白的表達。PPAR-γ 能夠激活長鏈和短鏈脂肪酸線上粒體內的 β- 氧化反應，最終透過氧化磷酸化消耗氧氣。成熟的結腸細胞消耗大量氧氣以維持其氧化代謝狀態，同時導致腸道內腔環境中的氧氣含量低於 1％。結腸上皮細胞透過這種機制可確保厭氧型益生菌的相對優勢，從而保持腸道穩態與健康。
結腸細胞在維持腸道穩態平衡中的作用表明，腸道菌群的不平衡可能是由上皮細胞代謝功能缺陷引起的。為了深入了解腸道穩態平衡破壞的機制，Byndloss 博士透過抗生素處理造成腸道菌群分泌短鏈脂肪酸「SCFA」的能力下降，由於 SCFA 參與上皮細胞的線粒體 β- 氧化過程，因此這一處理導致腸道局部低氧環境遭到破壞，腸道菌群的穩態也間接受到影響。
除了調節腸道上皮細胞代謝活性之外，SCFA 還透過維持粘膜中的調節性 T 細胞的數量來抑制腸炎，在抗生素處理模型中，SCFA 分泌水平的下降會導致 PPAR-γ 信號下調，從而降低調節性 T 細胞的數量，這進一步導致腸炎的發生。在炎症反應發生之後，促炎性信號則會促使結腸上皮細胞代謝向糖酵解方向轉變，從而降低氧氣的消耗，這將促進兼性厭氧型腸桿菌科細菌的大量生長。
該研究發表在 2017 年的 Science 雜誌上，文章題為「Microbiota-activated PPAR-γ signaling inhibits dysbiotic Enterobacteriaceae expansion」13。
1.3 腸上皮細胞對腸道菌群穩態的維持作用
除了受細菌影響之外，其它因素引發的腸道炎症也會造成腸桿菌的異常增殖。在另外一項研究中，Byndloss 博士利用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導小鼠腸炎的發生。在這一過程中，腸上皮在受損之後的修復過程中會導致分化後的結腸細胞丟失，這進一步會促進腸道氧氣含量的增加，最終使能夠進行有氧呼吸的腸桿菌科細菌收益 13。
綜上所述，Byndloss 博士的研究表明，結腸細胞透過有氧代謝營造高度缺氧的腸道環境，促進厭氧型益生菌的生長以及腸道菌群的穩態平衡。腸道上皮細胞耗氧能力的破壞以及腸腔中氧氣含量的升高則會導致兼性厭氧細菌的繁殖，這與腸道營養不良和炎性疾病的發生極為相關。基於這些發現，Byndloss 博士希望這些知識有助於尋找新的治療腸道各類代謝性疾病，炎性疾病以及腸癌的靶標。
2. 如何調控體內微生物代謝產物的水平
2.1 關於郭春君博士
郭春君博士本科畢業於復旦大學，2015 年獲得南加州大學博士學位。博士畢業後在加州舊金山分校 Michael Fischbach 課題組進行了為期四年的博士後訓練，並於 2018 年加入 Weill Cornel 醫學院開展獨立研究工作。自博士後階段開始至今，郭博士始終致力於研究腸道常見細菌 ——Clostridium （梭菌屬）家族成員以及其代謝產物對宿主健康的影響。
（郭春君博士，www.sciencemag.org）
2.2 傳統腸道菌群代謝產物研究的缺陷
了解腸道菌群代謝產物相關研究的同學們或許會熟悉，目前該領域的主流研究手段無外乎兩種：其一是透過口服或注射的方式給實驗小鼠「匯入」細菌代謝產物，進一步觀察其表型；其二是透過改變細菌產生特定代謝產物的水平，再透過接種的方式比較其對宿主各項生理指標的影響。這兩種方法均能夠一定程度上揭示腸道微生物及其代謝產物的生理學功能。然而，郭博士認為，上述傳統的實驗方法缺少明確的「背景（對照）」。例如，我們無法準確得知目標代謝產物的生理濃度以及定植菌株的其它潛在生物活性。
2.3 精確遺傳修飾揭示 Clostridium sporogenes 代謝產物的生物學特性
郭博士認為，為了得到更加準確的結論，研究人員需要對受試菌株的代謝產物分泌水平進行精細調節，並且要保證「單一變數」這一前提條件。為了達到這一目的，理論上我們需要充分了解微生物代謝相關遺傳調控機制以及掌握精確修飾微生物遺傳資訊的技術手段。然而，腸道內能夠分泌代謝產物的菌群主要來自於 Clostridium 屬，而該屬成員的遺傳資訊很難進行人為修飾。
針對這一問題，郭博士引入了強大的 CRISPR/Cas9 基因編輯工具，並且對一種名為「Clostridium sporogenes」的腸道菌株進行了遺傳修飾 4。眾所周知，CRISPR/Cas9 最初被開發用於哺乳動物細胞的基因編輯，雖然一些研究也成功地將該技術應用於大腸桿菌，但後者的遺傳資訊已經得到了充分揭示。相比之下，對 Clostridium sporogenes 進行 CRISPR/Cas9 基因編輯無疑兼具創新性與挑戰性。
那麼，Clostridium sporogenes 難以進行遺傳改造的根本原因是什麼呢？郭博士認為，其中很大程度上是由於 Clostridium sporogenes 內源性同源重組事件發生機率極低。在長達數個月的嘗試與失敗之後，郭博士終於發現了提高 CRISPR/Cas9 基因編輯效率的關鍵：將 guideRNA 與 Cas9 分批次地先後匯入細菌內部，從而提高細菌對外部 DNA 的攝取效率。基於這一改良，郭博士團隊成功地得到了多個代謝產物合成突變菌株，並最終匯入宿主體內進行生物學功能的探究。相關文章發表在 2019 年的 Science 雜誌上，文章題為「Depletion of microbiome-derived molecules in the host using Clostridium genetics」。
2.4 「支鏈短鏈脂肪酸」調節宿主免疫
另一方面，對腸道菌群進行精確遺傳修飾的技術突破也幫助郭博士找到了另外一種新型的細菌代謝產物 —— 支鏈短鏈脂肪酸（BSCFA）。很多研究已經表明，SCFA 對於調節宿主免疫系統具有十分重要的作用，但人們對於這種結構上相似的 BSCFA 的功能卻缺乏了解 5。對此，郭博士比較了小鼠在接種 BSCFA 合成能力存在差異的菌株後出現的表型差異。結果表明，BSCFA 會抑制腸道 IgA 漿細胞的水平，同時也會降低 IgA 與天然免疫細胞結合的程度。這一發現表明 BSCFA 或許有助於調節 IgA 相關免疫系統功能。
2.5 建立可遺傳修飾的腸道微生物庫
雖然腸道中微生物總量十分龐大，近年來關於腸道微生物宏基因組的檢測數量也多達 9 萬次 6，但目前可被遺傳修飾的僅佔其中 5%。基於這一現狀，郭博士計劃在未來研究中建立一個通用的流水線，促進對更多不同類型腸道微生物的遺傳學修飾。此外，考慮到很多微生物對宿主的影響離不開復雜的微生態環境，郭博士還希望建立一個同時具備遺傳修飾特徵以及種群多樣性的腸道微生物庫。如果能夠成功，這將有助於進一步揭示腸道微生物與人體健康之間的因果聯繫，從而達到促進人體健康以及治癒疾病的目標。
3. 微生物組、獲得性免疫反應與組織修復
3.1 關於 Oliver Harrison 博士
本屆 NOSTER & Science Microbiome Prize 的最終大獎獲得者是 Oliver Harrison 博士。Oliver Harrison 本科與博士分別畢業於英國巴斯大學與牛津大學。在 NIH 進行了為期數年的博士後訓練之後，於 2019 年進入 Benaroya 研究所開展獨立研究工作。Harrison 博士的研究方向主要在於 T，B 細胞與共生菌群的相互作用，以及其在促進組織修復中的意義。
（Oliver Harrison 博士，www.sciencemag.org）
3.2 共生菌群如何影響宿主適應性免疫系統
眾所周知，免疫系統是保護宿主免受外部環境干擾，以及促進機體康復，恢復組織功能的關鍵元件 7。迄今為止，我們對宿主免疫系統的了解主要來源於炎症和病原微生物感染相關模型。然而，宿主與微生物之間的相互聯繫很大部分來自於共生菌群，它們對於宿主免疫系統的發育以及功能的維持同樣具有積極的意義。與病原微生物感染不同，宿主免疫系統在受到共生菌群信號刺激後，會激發特定的適應性免疫反應，增強上皮細胞的抗菌能力，進而保護機體免受病原體的威脅 8。
然而，其中有很多問題並沒有得到清晰的揭示。例如，宿主適應性免疫系統如何區分共生菌與病原微生物？宿主免疫系統與共生菌的相互作用是如何促進組織修復的？早在博士後階段，Harrison 博士就對上述問題產生了濃厚的興趣。透過最初對共生菌群特異性 T 細胞進行鑑定，追蹤以及特徵化描述，Harrison 博士發現了皮膚組織附近的共生菌特異性 T 細胞透過三種不同的方式參與宿主保護性免疫反應：非典型 MHC 識別，雜合分化以及直接促進傷口修復。
3.3 共生菌特異性「非典型」免疫反應
首先，Harrison 博士透過建立金葡菌皮膚感染模型，探索了皮膚組織中 T 細胞的抗原特異性 9。透過體外篩選以及計算機預測技術，發現 CD8+ T 細胞的應答需要非典型 MHC-I b 分子「H2-M3」呈遞含有 N – 甲醯甲硫氨酸的肽段（fMet 肽）發揮協同作用 10。這一發現表明，fMet 肽是一類能激活先天免疫系統的細菌特異性抗原，也能誘導針對非病原性細菌的適應性免疫反應。透過構建轉基因小鼠進行體內示蹤，Harrison 博士證明這一類群的 CD8+ T 細胞具有組織特異性記憶細胞特徵，發揮了維護皮膚屏障的「哨兵」作用。相關結果發表在 2018 年的 Cell 雜誌上，文章題目為「Non-classical Immunity Controls Microbiota Impact on Skin Immunity and Tissue Repair」。
3.4「平衡 II 型」免疫反應參與共生菌識別與組織修復
為了研究皮膚局部微環境對於共生菌特異性 CD8+ T 細胞的影響，Harrison 博士評估了細胞因子產生和效應。研究表明，與病原體感染通常引起的 CD8+ T 細胞分化特徵不同，共生菌特異性 CD8+ T 細胞通常會向異常的「雜合狀態」進行分化。
具體而言，CD8+ T 細胞會同時表達兩種轉錄因子 —— RORγt 和 GATA-3。眾所周知，RORγt 和 GATA-3 對於 Th17（抗真菌）以及 Th2（抗寄生蟲）細胞分化具有關鍵影響，而且通常情況下上述兩種轉錄因子的表達是「彼此排斥的」。為了研究這種共表達的形成原因及其影響，作者對共生菌特異性 CD8+ T 細胞的表觀遺傳學特徵以及轉錄情況進行了細緻分析。結果表明，儘管上述 CD8+ T 細胞中存在高水平的 IL-5 和 IL-13 的 mRNA 分子，但並沒有最終翻譯形成 IL-5 或 IL-13 蛋白。因此，Harrison 博士認為在健康的皮膚組織中，共生菌特異性 CD8+ T 細胞採用了獨特的分化模式，並將其稱為「平衡 II 型免疫」。
鑑於共生菌特異性 CD8+ T 細胞在解剖上與上皮細胞的接近程度以及在炎症反應過程中的「高度可塑性」，Harrison 博士對於這些「哨兵」在組織修復的作用十分感興趣。透過使用傷口上皮組織再上皮化作為組織修復效果的量化標準，Harrison 博士觀察到皮膚損傷部位的共生菌定植以及共生菌特異性 CD8+ T 細胞的募集會加速傷口修復。而該過程的速率取決於組織損傷後共生菌特異性 CD8+ T 細胞產生 IL-13 蛋白的能力 11。上述結果發表在 2019 年的 Science 雜誌上，文章題為「Commensal-specific T cell plasticity promotes rapid tissue adaptation to injury」。
基於前期的研究成果，Harrison 博士認為共生菌與宿主免疫細胞的相互作用在組織損傷修復過程中具有十分重要的作用。對這一機制的理解有助於在未來開發相關的免疫療法，從而讓更多組織損傷患者受益。
以上就是三位青年科研人員對自己在微生物領域的研究進展的介紹，希望能夠對讀者朋友以及從業人員起到幫助，謝謝大家！
參考資料
1. Guo et al., Science. DOI: 10.1126/science.abc5620
2. Harrison et al., Science. DOI: 10.1126/science.abc5618
3. Byndloss et al., Science. DOI: 10.1126/science.abc5619
4. Guo et al., Science. DOI: 10.1126/science.aav1282
5. Rooks and Garrett, Nat. Rev. Immunol. DOI: 10.1038/nri.2016.42
6. Almeida et al., Nature. DOI: 10.1038/s41586-019-0965-1
7. Harrison et al., Immunity. DOI: 10.1016/j.immuni.2017.04.008
8. Honda and Littman., Nature. DOI: 10.1038/nature18848
9. Naik et al., Nature. DOI: 10.1038/nature14052
10. Linehan et al., Cell. 10.1016/j.cell.2017.12.033
11. Harrison et al., Science. DOI: DOI: 10.1126/science.aat6280
12. Byndloss et al., Nat Rev Immunol. DOI: 10.1038/nrmicro.2017.158
13. Cevallos et al., mBio. DOI: 10.1128/mBio.02244-19
來源公眾號：丁香學術
