「救命!做 WB 蛋白樣品提取時,樣品加入裂解液,離心後發現管裡有很多的膠狀物,非常粘稠,有點像鼻涕!多加裂解液稀釋一下仍然沒有效果,蛋白濃度還變得很低。不死心的我把它戳出來玩了一會,戳戳戳仍然是一大團,這粘稠物是什麼?對我的後續實驗會有什麼影響?」
當你看到這團粘稠的「鼻涕」,就意味著你即將經歷下面五個難題的考驗:
1. 樣品吸液困難
堵塞移液器:離心後吸上清液的時候膠狀物會堵塞移液器頭,移液後上清液所剩無幾。
無法分離上清液:樣品太過粘稠,移液吸取時會整體帶出,無法分離上清液。
2. 定量困難
無法測定及定量:樣品粘稠無法成為均一液體,導致蛋白定量 OD 值 out,無法進行定量測定。
3. 樣品很難進入膠孔
上樣困難:儘管加了 loading 進行煮樣,上樣樣品仍然特別粘稠,很難加入到膠孔。
4. 樣品很難跑出孔發生拖帶
電泳結果不佳:SDS-PAGE 時粘稠樣品會卡在點樣孔裡,條帶不成直線,有很嚴重拖尾,條帶不集中。
5. 粘稠的樣品通常無法獲得好結果
蛋白丟失:粘稠物包裹蛋白導致無法釋放,樣品很難跑出理想的結果,有時甚至是完全沒有條帶。
令人反感的粘稠「鼻涕」是怎麼形成的?
問題出在細胞裂解過程中,細胞中的 DNA 纏繞其他大分子物質,導致蛋白質聚集,再加上其他細胞碎片(如油脂、難溶蛋白等)共同形成粘稠的「鼻涕」狀態,也被稱為「核酸殘團」。
核酸殘團的存在大大降低了蛋白的提取效率,使得蛋白丟失,從而導致了 WB 實驗中的一系列問題。曾有研究者用不同方法進行小鼠脾臟和肝臟蛋白提取得到蛋白質圖譜[1]:
圖 1:從小鼠脾臟和肝臟中使用不同方法提取總蛋白的蛋白圖譜
條帶 1 為柱式法提取的蛋白樣品,條帶 2 為 RIPA 可溶組分(RIPA 裂解後的上清),條帶 3 為 RIPA 不可溶性組分(丟棄的沉澱部分)。實驗發現 RIPA 的不可溶組分蛋白質圖譜與可溶性組分圖譜相似,但是不完全相同。丟棄的不可溶組分中仍然可檢測到許多蛋白條帶,覆蓋了整個蛋白質圖譜分子量範圍,不同樣品的不可溶組分圖譜也各不相同。丟失的蛋白會引起蛋白圖譜發生變化,改變不同種類蛋白的比例,且具有隨機性和不可預測性,無法真實的體現樣品中蛋白的表達情況。
除以上問題外,核酸殘團的存在還會導致 WB 內參蛋白跑不齊、磷酸化蛋白難以檢測或趨勢不正確,WB 背景高等眾多問題。所以想得到真實的 WB 結果,必須要在樣品製備過程中去除這些粘稠物。
如何踢開樣品製備中的這塊「絆腳石」?
1. 超聲破碎
超聲波的能量可以破壞蛋白複合物,切割染色質,從而改善樣品粘稠狀態。但該方法存在一些弊端,如:
1)經過超聲波的處理,樣品會產生很多泡沫,影響蛋白濃度測定及後續實驗;
2)超聲過程產生的熱量,會導致蛋白質變性或者降解。如做蛋白的磷酸化研究儘量避免使用該方法;
3)需要反覆清洗探頭可能產生樣品間的交叉汙染;
4)裂解液體系較小的樣品,損失較多不適宜直接利用探頭超聲;
5)無法達到將蛋白與核酸完全分離的效果。
2. 使用核酸酶降解核酸
核酸酶可將蛋白樣品中的核酸降解,改善樣品粘稠狀態。但核酸酶無法水解緊密的核染色質,且裂解液中含有的表面活性劑和鹽等成分會抑制核酸酶對核酸的降解效率,無法起到最佳效果。
3. 推薦優選柱式法進行蛋白樣品提取
解決蛋白樣品粘稠的最佳方式是改變蛋白質的製備方式,可以選擇新一代柱式蛋白提取法替代傳統的裂解液法。柱式法通過使用最佳化的裂解液配方,可有效提高裂解液對樣品的裂解效率,特別是可以提升難溶蛋白的溶解效率。同時配合使用離心管柱技術有效阻截核酸,讓蛋白溶液瞬間澄清無粘稠物產生,無需複雜操作,即可獲得高質量無丟失的蛋白樣品。
測試實例:裂解液法 VS 柱式法
同種樣品分別使用裂解液法和柱式法進行 WB 樣品製備,SDS-PAGE 電泳後考染如圖 2,左條帶為使用普通強裂解液提取的蛋白樣品,右條帶為柱式法提取的蛋白樣品,可見使用柱式法法提取的樣品膠孔中可明顯改善樣品滯留、拖帶的情況發生。
圖 2:同種樣品分別使用裂解液法和柱式法進行 WB 樣品製備,SDS-PAGE 電泳後考染圖
圖片來源:英文特
WB 蛋白樣品製備過程中出現樣品粘稠的情況並不代表樣品提取失敗,而是樣品裂解較為充分的表現,但是如果放任不管則會引發一系列連鎖效應,最終導致 WB 實驗失敗。選擇合適的方法進行處理。成功獲得高質量的蛋白樣品,是 WB 實驗成功必不可少的因素,千萬勿忽略!
內容審核:康晉偉
項目審核:周育紅
題圖來源:圖蟲創意
文章來源:英文特
參考文獻:
[1]. Li,Q. (2016).Pitfalls of Protein Extraction by RIPA Buffer. Biotechniques. 61:327.
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