Science丨CRISPR激活和干擾篩選平臺解碼原代人T細胞反應

撰文丨唐小糖

多年以來,Cas9的遞送效率不高極大地限制了其在原代細胞中的應用。2018年,Cas9瞬時電穿孔引入的基因敲除已可在人類原代細胞中進行基因組規模的CRISPR篩選【1-2】。然而全面研究包括gain-of-function和loss-of-function所需的CRISPR激活(CRISPRa)和CRISPR干擾(CRISPRi), 因為其需要持續表達內切酶dCas9,但慢病毒遞送效率卻不高,所以仍然只被限制在小規模實驗中【3-4】

2022年2月4日,加州大學舊金山分校Alexander Marson團隊在Science上線上了題為CRISPR activation and interference screens decode stimulation responses in primary human T cells 的研究論文,在原代人類T細胞中開發了允許系統性研究基因和通路的CRISPRa和CRISPRi篩選平臺,並解碼了人T細胞細胞因子反應。

研究人員開發了最佳化的高低毒慢病毒生產平臺,採用最小的dCas9-VP64載體(pZR112),允許轉導效率高達80%。擴大平臺後,可以用超過112000個sgRNAs對超過18800個蛋白質編碼基因進行全基因組CRISPRa篩選。基於此,研究人員分選分泌IL-2的CD4+ T細胞和分泌IFN-g的CD8+ T細胞及各自對照,並用sgRNA進行證實。IL-2和IFN-g CRISPRa分別篩選出了444和471個基因,其中有171個共享,包括TCR信號複合體相關成員如VAV1、CD28、LCP2和LAT等。研究人員同樣利用最佳化的CRISPRi平臺分別對IL-2和IFN-g篩選,分別得到了226和203個基因,其中有92個基因共享。兩種方法所傾向的基因表達量不同,以互補的方式繪製了T細胞刺激反應性細胞因子產生的遺傳回路。

接下來,研究人員進行了陣列式CRISPRa實驗,以加深對篩選結果的表型特徵分析,選擇了14個基因進行驗證,其中13個基因對相關細胞因子的陽性比例產生明顯變化。隨後,研究人員通過測量48種分泌的細胞因子和趨化因子的廣泛面板來評估單個CRISPRa是如何對細胞因子進行重程式設計的。結果顯示不同的調節因子所增加的細胞因子類別模式不同,如VAV1和FOXQ1增加I型細胞因子,OTUD7B增加II型細胞因子。為了評估每個CRISPRa基因誘導產生的全圖譜分子特徵,研究人員開發了一個結合了CRISPRa與單細胞RNA-seq(scRNA-seq)(CRISPRa Perturb-seq)結果的平臺,在約56000個原代人T細胞中進行刺激反應調節因子的CRISPRa Perturb-seq表徵,共篩選到了70個靶基因。根據基因特徵以及比較對照sgRNA組內的靜止和刺激細胞計算得出了scRNA-seq的激活分數,分析後發現,許多負調控因子驅動不同細胞因子基因表達的模式相同,而正調控因子一般會促進更多不同的細胞因子基因表達。

最後,研究人員進行聚類分析,確定了15個主要的細胞集群,其中有兩個IL-2高表達集群,兩個IFN-g高表達集群,前者由VAV1和OTUD7B sgRNAs促進,後者以CCL3和CCL4高表達為標誌,且富含高激活分數的sgRNA,如VAV1、CD28等。這些結果表明,CRISPRa Perturb-seq很好地揭示了分泌細胞因子的調節因子是如何調控T細胞的激活以及對細胞的不同刺激反應狀態進行重程式設計的。

總的來說,本研究展示了一個在原代人T細胞中進行大規模CRISPRa和CRISPRi篩選的強大平臺,CRISPRa和CRISPRi互補篩選使得調節細胞因子分泌的基因網路功能圖譜得以全面體現。通過陣列表型分析和集合scRNA-seq方法對CRISPRa靶基因進一步研究,表徵了關鍵基因的具體功能,揭示了T細胞的調節始末,對未來的細胞治療提供了強有力的武器。

原文地址:

https://doi.org/10.1126/science.abj4008

製版人:十一

參考文獻

1. E. Shifrut et al., Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell 175, 1958–1971.e15 (2018).

2. P. Y. Ting et al., Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells. Nat. Methods 15, 941–946 (2018).

3. X. Chen et al., Functional interrogation of primary human T cells via CRISPR genetic editing. J. Immunol. 201, 1586–1598 (2018).

4. R. Nasrallah et al., A distal enhancer at risk locus 11q13.5 promotes suppression of colitis by Treg cells. Nature 583, 447–452 (2020).

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