NBT | David Liu團隊開發CRISPR非依賴的線粒體胞嘧啶鹼基編輯器DdCBEs的升級之路

撰文 | 木蘭之枻

責編 | 兮

真核生物的細胞核和線粒體中均有DNA存在,且細胞核和線粒體DNA突變均會導致各類疾病。為開展功能研究和疾病治療探索,研究者已開發出多種DNA精準編輯系統,鹼基編輯器CBEs便是其中的代表性工具。目前可編輯細胞核DNA的鹼基編輯器均依賴於CRISPR系統,其可編輯位點受CRISPR的PAM序列特性影響,因此存在侷限性。可編輯線粒體DNA的鹼基編輯器DdCBEs是將胞苷脫氨基酶DddA與TALENs融合而得(圖1),不依賴於CRISPR系統(詳見BioArt報道:Nature新突破 | David Liu開發新工具實現線粒體內的高效單鹼基編輯)【1】,但效率偏低,且存在嚴重的序列偏好性(僅對TC位點有較高的編輯效率),需要進一步的最佳化和改進。

2022年4月4日,來自美國哈佛大學Broad研究所和霍華德休斯研究所(HHMI)的David Liu實驗室在Nature Biotechnology發表題為CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA的論文。文章藉助David Liu實驗室開發的蛋白定向演化技術PANCE和PACE,對線粒體DNA精準編輯工具——胞嘧啶鹼基編輯器DdCBEs進行了多重最佳化和改造,最終獲得編輯效率更高且序列兼容性更強的升級版DdCBEs。新工具對線粒體DNA和細胞核DNA均有較強的精準編輯能力,為線粒體DNA及細胞核DNA的機制研究和治療探索提供了更強大的新武器。

研究者前期曾開發出兩種蛋白定向演化技術——噬菌體輔助連續演化系統(PACE)和噬菌體輔助非連續演化系統(PANCE)【2-3】,這兩種技術均通過噬菌體和宿主大腸桿菌連續共培養策略來進行蛋白質定向進化,並已成功用於包括細胞核DNA鹼基編輯器在內的多種基因編輯工具的改造。與PACE相比,PANCE技術的起點低且不會丟失突變資訊,因此適合蛋白的初始最佳化。因此本研究中PANCE首先被應用於DdCBEs的最佳化改造,以提升其在TC序列的編輯能力。經PANCE定向演化後,研究者發現脫氨基酶DddA中引入T1380I點突變(稱為DddA1)能有效提升DdCBEs在HEK293T細胞線粒體中的編輯效率。在DddA1突變體的基礎上,研究者進一步利用PACE進行深度最佳化並開發出四種突變體DddA2-5,其對線粒體DNA中TC序列的編輯效率大幅提升(從7.6 ± 2.4%最高提升至24 ± 4.4%)。研究者還對DddA4和DddA5兩種突變體的點突變進行組合並獲得DddA6(Q1310R + S1330I + T1380I + T1413I),其編輯效率也進一步提升至26 ± 3.7%。

圖1 DdCBEs的基本工作原理

圖1 DdCBEs的基本工作原理。

雖然DddA6突變體能高效編輯TC序列中的胞嘧啶,但對非TC序列中的胞嘧啶缺乏有效的編輯能力。為此研究者對PANCE和PACE系統進行微調,並在DddA1突變體的基礎上進行蛋白定向演化以獲得序列兼容性更高的新工具。經多輪篩選最佳化後,研究者優選出DddA7-11五種突變體並對其鹼基編輯的序列兼容性進行綜合評估。結果顯示,DddA11(攜S1330I、A1341V、N1342S、E1370K、T1380I和T1413I六種突變)在AC(4.3–5.0%)和CC(7.6–16%)處的編輯效率最高。

除編輯效率外,脫靶風險對鹼基編輯器的應用前景也非常重要。研究者利用ATAC-seq測序技術在HEK293T細胞中對DdCBEs的脫靶風險進行評估。結果顯示,與初始版本相比,DddA6和DddA11衍生而來的DdCBEs變體在ND5.2和ATP8兩位點的脫靶風險有一定程度的增加。研究還發現,DdCBEs中TALENs組分結合DNA能力的特異性對脫靶風險也有重要影響。不過綜合而言,雖然最佳化後的DddA6和DddA11會導致脫靶位點突變率的增加,但脫靶位點/靶位點突變率的比值並無明顯的改變。研究者還發現,雖然在特定條件下DddA11具有更寬的活性窗口,但總體而言DddA6和DddA11的活性窗口與初始版本相似。

為驗證改進後的DdCBEs線上粒體DNA鹼基編輯中的效果,研究者用DddA6和DddA11突變體線上粒體DNA的特定位點開展致病點突變的構建。結果顯示DddA11在非TC序列(ACT、GCT和CCA)能有效誘匯出對應的致病點突變(效率為7.1%~29%),且相應點突變會導致線粒體呼吸鏈功能明顯受損,證實了升級後的DdCBEs線上粒體功能研究中的廣闊應用前景。

研究還指出,將線粒體定位信號改換為細胞核定位信號,DdCBEs還可以實現核基因組TC位點的精準編輯,升級後的DddA11在非TC序列AC、CC和GC處同樣具有可觀的鹼基編輯能力。而且細胞核定位的DddA6和DddA11與初始版本有相似的脫靶風險。

總體而言,研究者藉助成熟的蛋白定向演化技術,實現了線粒體靶向的鹼基編輯工具DdCBEs的更新換代,升級後的DdCBEs具有更高的鹼基編輯效率和序列兼容性,因而具有更為廣闊的應用前景。研究者還證實,通過改變亞細胞定位信號,DdCBEs還可被改造為細胞核基因組適用的鹼基編輯器。DdCBEs的升級和改造為線粒體功能及治療研究提供了更加有效的工具,也為細胞核基因組的精準編輯提供了更多選擇,拓展了基因組精準編輯的應用場景。

原文連結

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01256-8

製版人:十一

參考文獻

1. Mok, B. Y. et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 583, 631–637 (2020).

2. Thuronyi, B. W. et al. Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity. Nat. Biotechnol. 37, 1070–1079 (2019).

3. Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G. & Liu, D. R. Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2. ACS Synth. Biol. 8, 796–806 (2019).

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