CRISPR-Cas 系統介導的基因編輯系統自問世以來帶給學術界和科學界極大的變革，甚至深刻地影響了人們對科學技術的認識。
科學家們也不斷地發現新的 CRISPR 蛋白以及改造現有蛋白，以實現更高效、更準確的基因編輯，其中最佳化 Cas 蛋白大小，提高遞送效率，對擴大基因編輯的工業化及實驗室應用具有重要的意義！
2020 年 7 月 17 日， CRISPR-Cas 基因編輯的開創者之一 UC Berkeley 的研究者 Jennifer Doudna 發表題為 CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor 的文章 [1]，報道了一種來源於巨大噬菌體的超緊湊型（hypercompact）CRISPR-CasΦ（CasF）基因編輯系統，只有傳統 Cas9, Cas12a 系統約一半大小，可以在體外實驗、人類細胞以及植物細胞中產生有效的基因編輯能力。這一發現將極大的最佳化 CRISPR 基因編輯的遞送系統，具有廣泛的應用價值。
圖片來源：Science
研究內容：
巨大噬菌體的 CasF 是優秀的 CRISPR-Cas 系統
CRISPR-Cas 系統是原核生物適應性免疫系統，通常只能在細菌來源的基因組中發現，但最新的研究發現無處不在的巨大噬菌體基因組中也普遍存在 CRISPR-Cas 系統 [2]。巨大噬菌體中的 CRISPR 缺少間隔序列（spacer）獲取機制，即 Cas1，Cas2，Cas4 等蛋白，通常具有更緊湊的 CRISPR 排列，靶向競爭性的其他噬菌體或宿主的基因組。
CasF 蛋白僅 70~80kDa，約為 Cas9 或 Cas12a 的一半。包含一個 C – 端 RuvC 結構域，與 TnpB 核酸酶超家族（V 型 CRISPR 蛋白被認為由此家族進化而來）具有遠同源性。
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Jennifer Doudna 等探究了三種 CasF 系統，CasF-1，CasF-2，CasF-3，在細菌系統中發現 CRISPR-CasF 透過 2-5 bp 的 PAM（protospacer adjacent motif） 實現識別自我和非我 DNA。cr-RNA 可以介導雙鏈 DNA 識別，只需要富含 T – 的 PAM 序列（CasF-1，CasF-3）或 5′-TBN-3′ PAM 序列（CasF-2），限制較小。
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研究者透過大腸桿菌表達系統及質粒干擾檢測來研究 CRISPR-CasF 行使功能所需的元件，發現 CasF 系統並不需要 tracrRNA，可以透過改變 gRNA 可以快速實現對其他 DNA 的靶向切割。
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CasF 是一個具有切割 crRNA 互補 DNA 的「bona fide」CRISPR-Cas 系統，如其他噬菌體的 DNA。該系統比現有的 CRISPR-Cas 系統更為緊湊小巧。
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CasF 系統體外切割 DNA
Patrick Pausch 等人在體外將 CasF 與不同的底物進行孵育，發現實現切割要求一個同源的 PAM 以及一個 ≥14 nt 的間隔序列。
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CasF 切割底物產生於 Cas12a 和 CasX 相似的 8-12 nt 5′- 末端。
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CasF-2、CasF-3 比 CasF-1 具有更好的體外活性，RuvC 活性位點內切割非靶向鏈（Non-targeted strand, NTS）速度比靶向鏈（targeted strand, TS）更快。而且，CasF 切割單鏈 DNA，而不切割單鏈 RNA。CasF 的反式切割活性僅在順式 DNA 識別後被發現，同時，由於對 PAM 序列的要求低，它可能具有更廣的核酸識別能力 [3,4,5]。
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CasF 透過 RuvC 活性位點處理前體 crRNA 成熟
CRISPR-CasF 系統必須透過成熟的 crRNA 介導外源 DNA 切割。V 型 CRISPR 系統透過 RuvC 活性位點之外的活性區域或招募 RNase III 來切割前體 pre-crRNA–tracrRNA。
那麼缺少 tracrRNA 的 CasF 系統是不是由其自身催化 RNA 前體成熟的呢？
研究證實了這一點。研究發現 CasF 系統只有在 Mg2+ 依賴的條件下才能催化 crRNA 成熟，RuvC 突變體（不結合 crRNA 前體且不影響蛋白穩定性的突變）不能催化 crRNA 成熟。
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透過對比 RuvC 切割 crRNA 前體和 V 型 CRISPR-Cas 切割後的 crRNA 產生的末端的差異，發現單一的 CasF-RuvC 活性區可以同時實現 pre-crRNA 處理和 DNA 切割。
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CasF 系統可有效切割人類細胞和植物細胞
CasF 切割 HEK-293 細胞
作者在常用人類細胞系 HEK293 中構建 EGFP 報告系統，檢測 CasF-1，CasF-2 兩個系統的切割能力。
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據報道，CasF-2 系統用單個 sgRNA 進行基因編輯，可以達到 33% 的敲除效率，與此前報道的 CRISPR-Cas9，CRISPR-Cas12a，CRISPR-CasX 相差不大 [6,7,8]。
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CasF 編輯擬南芥基因 PDS3
Jennifer 等人透過 RNP 方式將 CasF-2 匯入擬南芥原生質體中，對 PDS3 基因進行編輯，二代測序發現 CasF 可以造成 8~10 個 bp 的鹼基缺失突變，與體外實驗中造成的切割是基本一致的。
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鑑於 CasF 的大小遠比現有其他 CRISPR-Cas 系統更有優勢，並且 PAM 對靶向序列的限制更小，無論是對於載體為基礎的細胞內遞送以及擴展可靶向序列的範圍都有很強的優勢。
不同 CRISPR-Cas 系統的 RNA 處理及 DNA 切割示意圖
研究總結：
CRISPR-Cas 系統普遍存在於原核生物中，在外來病毒感染或質粒轉染時，為微生物提供適應性免疫。Jennifer A. Doudna 研究組在 Science 發表其最新研究，報道了一種具有功能的最小化 CRISPR-Cas 系統，僅由一個約 70kDa 的蛋白 CasF，CRISPR 排列元件（巨大噬菌體基因組中特異性編碼）組成。CasF 利用單個活性位點同時針對 CRISPR RNA （crRNA）和 guide-RNA，特異性切割外源核酸分子。這種超緊湊（hypercompact）系統在體外系統、人類細胞以及植物細胞中都具有活性，並且相對其他 CRISPR-Cas 蛋白具有更強的靶點識別能力。
最惹人矚目的是，這個系統在具有基因編輯及 DNA 檢測的功能的同時，僅僅只有 Cas9 和 Cas12a 基因編輯酶的一半分子量，這對於基因編輯的細胞遞送能力是一個革命性的突破，極大的豐富了基因編輯工具，可能具有更好的應用價值。
參考資料
[1]Patrick Pausch et al., Science (2020) DOI: 10.1126/science.abb1400
[2] B. Al-Shayeb et al., Nature 578, 425–431 (2020)
[3] J. S. Chen et al., Science 360, 436–439 (2018).
[4] A. East-Seletsky et al., Nature 538, 270–273 (2016).
[5] J. S. Gootenberg et al., Science 356, 438–442 (2017).
[6]J.-J. Liu et al., Nature 566, 218–223 (2019).
[7]B. Zetsche et al., Cell 163, 759–771 (2015)
[8]P. Mali et al., Science 339, 823–826 (2013).
題圖來源：站酷海洛 Plus
