Nature:重新設計 Cas9 蛋白,解決脫靶問題,讓基因編輯更安全

撰文 | 王聰

來源 | 生物世界

CRISPR-Cas9 基因編輯技術,通過嚮導 RNA(gRNA)將 Cas9 酶靶向目標 DNA 序列,Cas9 酶切割目標 DNA 雙鏈,造成 DNA 雙鏈斷裂,DNA 在非同源末端連接(NHEJ)修復時出錯,從而實現基因敲除。

然而,CRISPR-Cas9 存在較為嚴重的脫靶效應,可能會在錯位的基因位點切割 DNA 雙鏈,從而導致潛在風險,這也是限制 CRISPR-Cas9 基因編輯臨床應用的一大因素。目前,國內外已開始進行多項基於 CRISPR-Cas9 基因編輯的臨床試驗,降低其脫靶效應是一個亟待解決的問題。

2022 年 3 月 2 日,美國德州大學奧斯汀分校的研究團隊在 Nature 期刊發表了題為:

Structural basis for mismatch surveillance by CRISPR–Cas9 的研究論文。

研究團隊首先發現了 CRISPR-Cas9 基因編輯系統中脫靶背後的結構機制,在此基礎上重新設計了 Cas9 蛋白——SuperFi-Cas9,其脫靶概率降低了數千倍,且編輯效率與原始版本的 Cas9 蛋白相同

CRISPR-Cas9 基因編輯,通過嚮導 RNA(gRNA)將 Cas9 酶靶向目標 DNA 序列,Cas9 酶切割目標 DNA 雙鏈,造成 DNA 雙鏈斷裂,從而實現基因編輯,其中,嚮導 RNA(gRNA)長度為 20bp,通過與目標 DNA 的鹼基互補配對來識別需要編輯的位點,然而,有時候在第 18-20 個鹼基不匹配時,Cas9 酶仍能進行編輯,從而導致脫靶效應。

研究團隊使用冷凍電鏡來觀察 Cas9 與錯配的 DNA 序列相互作用時候的結構變化,從而解析錯配時 Cas9 的激活機制。

研究團隊驚訝地發現,當嚮導 RNA(gRNA)在第 18~20 個鹼基錯配時,這時的配對結構較為鬆散,但 Cas9 酶並沒有放棄前進,而是通過一個手指狀結構緊緊抓住了錯配區,從而穩定了 RNA-DNA 雙鏈,使其表現的像是正確配對,為 Cas9 對 DNA 的切割鋪平道路

論文的第一作者 Jack Bravo 表示,這種情況就像一把椅子,其中一條腿斷了,用膠帶粘上,這時候它仍然可以作為椅子使用,但是有些搖擺不定

俗話說,眼見為實,該論文的通訊作者 David Taylor 表示:如果不是通過冷凍電鏡看到了 Cas9 在嚮導 RNA(gRNA)錯配時出現的這種手指狀結構,自己在腦海裡永遠也想不到 Cas9 是通過這種機制增加了錯配時的結構穩定性,從而出現脫靶效應。

基於這一開創性發現和見解,研究團隊重新設計了 Cas9 酶,這一新版本的 Cas9 酶——SuperFi-Cas9,它的手指狀結構部分被改造成遠離 DNA,從而在錯配時,不會用來穩定錯配結構,因此 Cas9 酶就不再在錯配位點切割和編輯 DNA 序列

更重要的是,重新設計的 SuperFi-Cas9,可以像天然 Cas9 酶一樣高效編輯 DNA,但脫靶概率下降了約 4000 倍,因此安全性得到了大幅提升

目前,已經有其他實驗室通過重新設計 Cas9 來降低其脫靶效應,但所有這些 Cas9 版本都通過犧牲基因編輯效率來提高準確性。

對於這種現狀,這篇 Nature 論文的第一作者 Jack Bravo 做了一個形象的比喻:不同實驗室開發的不同 Cas9 版本就像不同型號的自動駕駛汽車,大多數都很安全,但它們的最高速度只有 10 英里/小時,雖然安全性提高了,但實用性也消失了。而 SuperFi-Cas9 則是一輛可以全速行駛且非常安全的自動駕駛汽車,SuperFi-Cas9 的脫靶概率比原始版本 Cas9 要降低 4000 倍,而且編輯效率一樣高

目前,研究團隊已經證明了 SuperFi-Cas9 在試管中對 DNA 的編輯,在活細胞中測試的實驗正在進行中,他們還在同步開發更安全、更高效的 Cas9 新版本。

據悉,研究團隊已經對這項技術申請了專利,德州大學奧斯汀分校技術商業化辦公司也正在尋找幫助這一技術實現轉化應用的合作伙伴。

CRISPR-Cas9 基因編輯技術,除了可能的脫靶效應外,Cas9 酶自身的大尺寸也是限制其更廣泛應用的一大難題。近年來,許多實驗室致力於開發尺寸更小的 Cas9 酶,從而實現更好遞送。

例如,史丹佛大學亓磊團隊於 2021 年 9 月在 Molecular Cell 期刊發表論文,重新設計一款全新的迷你 CRISPR 系統——CasMINI,它就像「瑞士軍刀」一般,小巧玲瓏卻又功能眾多,更容易傳遞到哺乳動物細胞中,因此可以更好地應用於 CRISPR 基因編輯的臨床治療

而 CRISPR 先驅、諾獎得主 Jennifer Doudna 教授共同創立的基因編輯公司 Mammoth Biosciences 也在研究和開發小型 Cas 酶,包括 Cas14 和 Casɸ。該公司於 2021 年 9 月獲得 1.95 億美元新融資,估值超過 10 億美元。

論文連結:

https://www.nature.com/articles/s41586-022-04470-1

https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(21)00648-1

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