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9月28日，素有「諾獎風向標」之稱的拉斯克獎揭曉，臨床醫學研究獎授予了香港中文大學的盧煜明教授，表彰他在使用胎兒DNA開發無創產前檢測方面的突出貢獻。
10月3日，備受矚目的2022年諾貝爾生理學或醫學獎揭曉，瑞典科學家斯萬特·帕博（Svante Pääbo）獲獎，表彰他在已滅絕古人類基因組和人類進化方面的發現。
但無論是利用母親血液裡的DNA去檢測胎兒的唐氏綜合徵，還是從幾萬年前的尼安德特人骸骨中提取DNA並進行測序，都離不開另一項偉大的技術——聚合酶鏈式反應（PCR）。
是的，就是那個被稱為「生物狗基本生存技能」的PCR，畢竟生物實驗中用到PCR的地方實在太太太多了！
來欣賞一下《PCR之歌》，感受生物狗對這項偉大技術的虔誠（強烈建議做不出實驗時可以聽聽）～《PCR之歌》是伯樂公司（Bio-rad）為推廣新產品而編寫的，原名Scientists for Better PCR
視訊來源：Bio-Rad
摸魚好幫手
PCR在生物實驗中到底有多常見？毫不誇張地講，從頂尖實驗室到大學課堂，從國際空間站到醫院檢驗科，你基本都能看到PCR儀的影子，它幾乎成了生物學、醫學研究中最必不可少的工具。
用於PCR的熱循環儀
圖片來源：wikipedia
PCR的全稱是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction），這是一種用於放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術。它的基本原理並不複雜，簡單而言，就是用人工技術不斷地循環複製DNA，讓它1變2，2變4，只需要循環10次就能得到原來1000倍的DNA，如果循環了20次就能得到驚人的100萬倍DNA！
PCR循環主要分3步：變性，退火，延伸。
變性：用高溫（94-96°C）讓DNA雙螺旋結構變性，使兩條互補鏈分開變成單鏈；
退火：降低溫度（50-65°C），讓引物與單鏈DNA結合，形成局部雙鏈；
延伸：DNA聚合酶（Taq酶，最佳活性溫度約為75-80°C）跟在引物後面，給單鏈DNA合成另一條互補的鏈，DNA的複製就完成了。
PCR循環示意圖
圖片來源：wikipedia
在自然狀態下，我們能提取到的DNA樣本濃度一般都比較低，只有經過擴增後才能用於測序等操作。在PCR技術誕生前，這可不是個輕鬆的活，擴增DNA序列需要在細菌中進行，整個過程極為麻煩且漫長，需要歷時數週；而現在有了PCR技術，我們只需要往管子里加入原材料，然後扔進PCR儀裡跑上幾十個循環，就可以輕鬆得到大量DNA序列～
用於批量檢測的PCR八聯排管
圖片來源：wikipedia
等待PCR儀跑循環的那一兩個小時，不知是多少生物狗光明正大摸魚的好時光。不過這麼好用的技術，它的誕生過程卻畫風清奇，如今正值PCR在學術圈大放異彩之際，我們可以簡單回顧一下它傳奇的誕生過程。
站在巨人肩上的技術
牛頓曾說過，「如果我比別人看得更遠，那是因為我站在巨人的肩上。」作為分子生物學騰飛標誌的PCR技術，它的誕生同樣離不開多位前人的鋪墊，事情還要從分子生物學的蠻荒年代說起。
1953年4月25日，劍橋大學的兩個年輕人詹姆斯·沃森（James Watson）和弗朗西斯·克里克（Francis Crick）發現了DNA雙螺旋結構，標誌著分子生物學時代的開啟，也為日後PCR的誕生打下最基礎的理論依據。1962年，他們被授予諾貝爾生理學或醫學獎。
詹姆斯·沃森（左）和弗朗西斯·克里克（右）
圖片來源：wikipedia
1956年，美國生物化學家亞瑟·科恩伯格（Arthur Kornberg）發現了第一個DNA聚合酶。人類得以窺視複雜的DNA複製機制，PCR無限擴增的原理就是建立在此之上：複製DNA需要先打開DNA雙螺旋，並保持其打開狀態，接著在酶的作用下合成新的DNA，最後再去除引物，並將所有片段連接在一起。1959年，科恩伯格被授予諾貝爾生理學或醫學獎。
亞瑟·科恩伯格
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20世紀60年代初，印度裔美國生物化學家哈爾·葛賓·科拉納（H. Gobind Khorana）在破譯遺傳密碼子方面取得了重大進展。除此以外，他還開發了許多合成寡核苷酸所需要的技術，寡核苷酸對於PCR至關重要，常被用作DNA聚合酶的引物。1968年，科拉納被授予諾貝爾生理學或醫學獎。
哈爾·葛賓·科拉納
圖片來源：wikipedia
1971年， 科拉納和他的學生謝爾·克萊普（Kjell Kleppe）在Journal of molecular biology雜誌發表的論文中，首次提出「使用DNA聚合酶進行修復合成」的概念，這也被視為PCR技術的早期構想。
1969年，美國微生物學家托馬斯·布洛克（Thomas D. Brock）從黃石國家公園的大稜鏡溫泉中分離出一種全新的嗜熱菌Thermus aquaticus，它們能在85℃以上的溫泉裡生存。
1976年，台灣的女科學家錢嘉韻在辛辛那提大學生物系讀研期間，從這種嗜熱菌中提取了能夠耐高溫的Taq聚合酶，這種酶後來被用於取代不耐高溫的大腸桿菌DNA聚合酶，大大簡化了PCR工作。
發現了Thermus aquaticus嗜熱菌的溫泉口，這美麗的彩虹色其實是嗜熱菌的顏色
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1977年，英國生物化學家弗雷德裡克·桑格（Frederick Sanger）發明了著名的桑格測序法。有了高效的DNA測序方法，人類終於能夠方便地讀出DNA片段序列，讓設計PCR引物的難度大大降低。1980年，桑格被授予諾貝爾化學獎。
弗雷德裡克·桑格
圖片來源：wikipedia
至此，在多位諾獎得主的鋪墊下，搭建PCR技術所需的所有零部件已悉數集齊，只等一個天選之子去將它們組裝到一起。
不務正業的天選之子
那個被命運選中的人叫凱利·穆利斯（Kary Banks Mullis），他於1944年12月28日出生於美國南部小城勒努瓦的一個農民家庭。
圖片來源：wikipedia
比起使用「傳奇」一詞，這位天選之子的人生經歷用「混亂」去形容似乎更為貼切，實在讓人大跌眼鏡。
小時候的穆利斯是個不折不扣的熊孩子，搞破壞是一把好手，但這並不影響他以優異的成績考入全美三大理工院校之一的佐治亞理工學院化學系。上了大學以後，受到嬉皮士運動的影響，他甚至迷戀上了某些不良嗜好，當別的同學都在乖乖上課做實驗時，他卻白天躲在宿舍吸食LSD（Lysergic acid diethylamide，D-麥角酸二乙胺，這是一種強烈的半人工緻幻劑），晚上再偷偷溜進實驗室裡合成。
本科畢業後，穆利斯進入加州大學柏克萊分校攻讀生物化學方向的研究生。但他依舊難改吊兒郎當的本性，在讀博期間選修了一門與專業毫不相干的——天體物理學。神奇的是，他竟然學得還不錯，甚至在1968年發表了一篇Nature論文。最後也是這篇文章幫他歪打正著地拿到了博士學位。
穆利斯的Nature論文《時間逆轉的宇宙學意義》
圖片來源：Nature
博士畢業後的穆利斯更加不務正業，先是轉行寫起了科幻小說，結果非但沒能寫出傳世名作，反而連自己的溫飽都成了問題。眼看就要入不敷出，他只得先後跑去堪薩斯大學醫學院和加州大學舊金山分校做博士後，幹起了宰殺小鼠的髒活累活。離譜的是，博後期間他竟然還在家甜品店裡打過工。
穆利斯的迷惑行為還有很多——他曾在諾貝爾獲獎致辭中反覆懷念前女友，結果50歲前就結了4次婚；他不相信全球氣候變暖，認為對臭氧層空洞是環保主義者的陰謀；他否認HIV病毒會導致愛滋病，覺得這是政府機構為了賺錢而提出的陰謀；他還宣稱自己曾與偽裝成浣熊的外星人對話過……
穆利斯的很多迷惑言行，都記載在自傳《心靈裸舞》中
圖片來源：archive.org
2019年8月7日，穆利斯因肺炎去世，走完了傳奇的一生，享年 74 歲。斯人已乘黃鶴去，空留 PCR 在人間。這樣一位放浪不羈的非典型科學家，咱們凡人不好評價，還是把時鐘撥到80年代，繼續說回PCR。
128號公路的發現之旅
1979年，受夠了殺小鼠工作的穆利斯在朋友的推薦下，入職了一家生物技術公司Cetus。Cetus的主營業務是基因產品，而穆利斯的工作就是為全公司的各種研發項目合成寡核苷酸。
Cetus意為鯨魚座，它於1971年在加州柏克萊成立，是最早的生物技術公司之一
圖片來源：wikipedia
合成寡核苷酸倒也不難，就是很慢。當時手工合成DNA主要是通過模擬體內合成，先將一個個核苷酸按順序排列好，再連接起來，速度慢得出奇，根本不夠實驗室的消耗。在化學合成上充滿天賦的穆利斯很快開發出計算機自動合成程序，大大簡化了工作流程。1981年，他當上了DNA合成實驗室的負責人。
1983年一個春天的晚上，穆利斯與當時同在Cetus工作的女友驅車前往鄉間的別墅度假。汽車疾馳在加州128號公路上，蜿蜒盤旋的道路漸漸在他眼前幻化成DNA雙鏈，不斷離合、延伸……
充滿傳奇色彩的加州128號公路
圖片來源：wikipedia
此時一個驚天念頭在他腦中閃現——擴增DNA片段時，如果同時添加兩條引物分別擴增，是不是隻要引物足夠，就可以無限擴增下去？
激動萬分的穆利斯當即停車，從手套箱裡取出筆和紙飛快地演算起來：DNA複製1次能變成2個，複製10次就是大約1000個，複製20次就有100多萬個了，要是能複製30次，就有驚人10億個，這可是人類基因組中鹼基對的總量啊！
回到公司後，穆利斯興沖沖地彙報了自己的想法，但卻沒有一個人支持他，同事們都認為他對分子生物一無所知，因此對他的想法表示質疑。再加上當時他和女友的感情也出現了問題，並且與實驗室其他同事的關係鬧的非常僵，實驗的進度被嚴重拖後。
磨磨蹭蹭到了1984年9月，Cetus公司派了幾位技術員加入到課題裡來，這給了半路出家研究分子生物學的穆利斯很多幫助。有了人手以後，實驗就順利多了。
雖然穆利斯的進度依舊緩慢，但他的2位同事亨利·埃利希（Henry Erlich）和諾曼·阿恩海姆（Norman Arnheim）在當年11月成功擴增了一個110bp的人源蛋白基因片段。事實證明，穆利斯的思路是對的， PCR是可行的！
這就是PCR技術雛形，但那時的PCR技術還不完善，仍有兩個問題需要解決。
第一個問題就是高昂的物力耗費。穆利斯最初用的是大腸桿菌DNA聚合酶，這種酶不耐熱，溫度一高就失活，導致每個循環都重新添加，不但麻煩，而且成本非常高。經過一番搜尋，錢嘉韻在9年前提取出的耐高溫Taq聚合酶給了穆利斯靈感，在公司另一組科學家的幫助下，Taq酶於1985年秋天被成功提取出來，並被馬上應用到了PCR中。
Taq聚合酶
圖片來源：wikipedia
另一個問題就是沒有自動化儀器進行PCR技術操作。當時PCR技術員的工作日常是這樣的：先分別將三個水浴槽的溫度恆定在變性溫度、退火溫度和延伸溫度，然後將PCR管放進變性槽裡泡著，等估摸著變性得差不多了再放進退火槽裡，最後放延伸水浴槽裡。這可是個十足的苦力活，幾十個循環下來，能把人直接累虛脫。
早期的熱循環儀，採用了敞口的設計以方便移動樣品
圖片來源：wikipedia
1987年11月19日，Cetus和珀金-埃爾默（Perkin-Elmer）合作開發的PCR儀正式迎來商用，PCR技術實現了自動化，解放了無數技術員的雙手。
1986年的熱循環儀原型機Baby Blue
圖片來源：wikipedia
至此，我們熟悉的那個PCR技術終於以完全體問世。
但傳奇故事的結尾似乎總是不完美，PCR也不例外。明明有著巨大的市場利潤，Cetus公司卻摳摳搜搜，只給了穆利斯1萬美元的獎金，團隊裡的其他人甚至只收到了象徵性的1美元，這波操作逼得穆利斯在1986年負氣出走；1992年，Cetus公司又因為研發失利，含淚以3億美元的價格將「搖錢樹」PCR技術專利賣給羅氏，從此消失在了歷史的洪流裡。
1993年，穆利斯因發明PCR而榮獲諾貝爾化學獎，他在獲獎致辭中大談童年時光與128號公路的神奇一夜，或許這是對他最好的補償了吧～
PCR技術的40年
PCR技術甫一問世，就為科學家們打開了一扇通往嶄新世界的大門。
例如在誕生之初的1986年，Cetus公司就有科學家利用PCR來測定血液中的HIV病毒循環量，並很快證明了可行性！這項成果於1987年被正式公佈，人們得以對捐獻的血液進行病毒篩查，並直接檢測抗病毒藥物的療效。
這項成果由Cetus公司的約翰·斯寧斯基（John Sninsky）主導
圖片來源：參考文獻1
另一個早期應用就是就是法醫學，很多兇案現場都會留下罪犯的DNA資訊，但僅憑現場殘留的微量DNA做身份鑑定還是不夠的，法醫們可以藉助PCR逆天的擴增能力，對DNA進行體外複製，再與罪犯DNA資料庫進行比較，精準鎖定兇手。1986年，基於PCR技術的DNA鑑定首次應用於實戰，成功確認了多個屍檢樣本來自同一個人。
PCR的應用還有很多，不僅僅是分子生物學的相關領域和產業，各行各業都留下了它的足跡，包括分子克隆、基因表達、轉基因檢測、農業與食品致病微生物檢測、病原微生物檢測、腫瘤診療、遺傳病檢測……可以說，這是一個改變世界的偉大技術。
此外，隨著現代分子生物學飛速發展，PCR技術也在日新月異，推陳出新。
在最初的手動水浴基因擴增和第一代自動化控制型以後，人們已不再滿足於不可視的PCR操作了，於是在PCR反應體系中加入同位素或者熒光基因，利用熒光信號積累實時監控整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知樣本進行定量分析，這也就是第二代實時熒光定量PCR，簡稱qPCR（Quantitative Real-time PCR）。如今新冠肺炎核酸檢測用的就是實時熒光定量PCR技術。
qPCR示意圖
圖片來源：wikipedia
而目前最新的PCR檢測方法則是第三代微滴數字PCR（Droplet-based digital PCR，ddPCR），第三代技術的優點是使用的樣本量極少，定量比常規的qPCR更精確，靈敏度更高，在液體活檢領域可以大展拳腳。
PCR家族遠不止於此，還有例如反向PCR、錨定PCR、Bubble-PCR、反轉錄巢式PCR……這些種類繁多的PCR技術能夠應對人類更高的需要和不同探究方向。
從1983年的靈光乍現至今，PCR技術已經走過了近40個年頭，它就像是最牢固的地基，承載著不斷升高的分子生物學大廈。下次大家在跑 PCR 時，別忘了感謝一下穆利斯老爺子和神奇的128號公路～
參考文獻：
[1] Kwok, Shirley & Mack, D & Mullis, K & BJ, Poiesz & Ehrlich, Garth & Blair, D & Friedman-Kien, A & Sninsky, John. (1987). Identification of human immunodeficiency virus sequence by using in vitro enzymatic amplification and oligomer cleavage detection. Journal of virology. 61. 1690-4. 10.1128/JVI.61.5.1690-1694.1987.
[2] Kary Mullis’ Nobel Lecture, December 8, 1993, from https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/lecture/
[3] https://en.wikipedia.org/wiki/History_of_polymerase_chain_reaction#cite_note-Saiki1-16
[4] https://en.wikipedia.org/wiki/Kary_Mullis
[5] https://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
[6] https://en.wikipedia.org/wiki/Thermal_cycler
[7]《傳奇PCR：從科學狂想到普通醫學檢驗室，這個故事裡每個關鍵人物都手握諾獎》，科研圈，2018-08-12
[8] 《今天，「PCR 之父」去世了，世間又少了一個有趣的靈魂…》，生物學霸，2019-08-10
作者：Ivan
本文經授權轉載自：科學大院（ID：kexuedayuan） 作者：Ivan
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