Cell:諾獎得主團隊研發新一代的微型化雙光子,實現大批量神經元雙光子鈣成像

闡釋哺乳動物高級腦功能的神經元集群編碼機制一直是當代神經科學的重點研究目標之一。近些年來,一系列可以在被試動物自由行為過程中記錄大批量神經元活動的新技術的開發使得這一研究目標有望得以實現【1-3】。光學成像就是這些新技術之一:得益於GCaMP等基因編碼的鈣指示劑(genetically-encoded calcium indicator,GECI)對神經元胞內遊離鈣離子濃度變化靈敏的探測能力,神經學家已經可以對顯微鏡視場內幾百甚至上千個神經元的神經活動進行實時觀測【4-6】。

能夠在清醒的齧齒類動物(小鼠、大鼠等)中對神經元進行功能成像的技術中,目前最被主流認可的是雙光子顯微鏡技術【7】。然而,長期以來研究者一直需要把實驗動物固定在這種光路複雜且體積龐大的顯微鏡的物鏡下方才能進行成像實驗。顯而易見的是,這種實驗正規化禁錮了實驗動物的自由活動,從而限制了能夠進行的科學實驗: 例如空間定位等需要實驗動物自主地進行多維空間探索(身體平移、頭部轉動、站立瞭望、鬍鬚觸碰等)的科學問題將無法得到很好的研究【8】。因此,在最近二十年裡科學家們進行了一系列的嘗試,試圖將大型的臺式雙光子顯微鏡進行微型化改造,從而使其能夠以微型探頭(微型雙光子顯微鏡)的形式佩戴在小鼠等實驗動物的頭部,並在其自由活動的狀態下進行神經元成像【9-14】。早期的嘗試普遍面臨著幾個問題:用於傳輸飛秒鐳射並將其匯入微型探頭的光纖具有較高的色散,使鐳射脈衝變寬,從而降低了激發效率;用於點掃描的微型掃描器件速度低,導致成像受動物運動的影響產生嚴重的偽跡;探頭自身重量對於實驗動物來說過大,同時用於熒光采集以及探頭控制的連接纜線不夠柔軟輕便,從而束縛了實驗動物的活動範圍和狀態。真正使得自由活動動物的神經元光學成像被普遍接受的是隨之而來的另一種替代方案:微型化單光子顯微鏡【3】。這種技術放棄了雙光子顯微鏡的光學層切(optical sectioning)和三維成像能力,以換取更為小巧的探頭以及更為輕便的純電學連接纜線。利用微型化單光子顯微鏡,在組織厚度較薄的區域【15,16】,或者組織厚度高但是標記相對稀疏的情況下【17】,可是實現接近單細胞解析度的成像。然而,由於空間解析度、光學層切能力和三維成像能力的犧牲,且對背景熒光噪聲過於敏感,微型化單光子顯微鏡無法在較厚的、多層分佈的大腦皮層進行很有效的單細胞解析度成像,因而從本質上限制了這項技術的發展和應用【18,19】。

以上提到的種種限制激發了最近5年來一系列新一代微型化多光子顯微鏡(包括雙光子和三光子)的出現。得益於微電子、微光學器件的發展,這些新的設計將微型化多光子顯微鏡的空間解析度、成像速度、軸向掃描能力提升到接近或達到大型臺式多光子顯微鏡的水平【9,10,20-23】。2017年,一個來自中國研究團隊的設計採用了i)新型的空心光子晶體光纖(HC-920)傳輸鐳射;ii) 高速微機電掃描器(MEMS)進行二維掃描,以及iii)柔性光纖束(supple fiber bundle, SFB)採集熒光得到了領域內較高的關注【9,10】。該設計的第二代版本實現了400微米x400微米成像視場和180微米軸向掃描能力【9】。然而,由於其探頭重量與之前版本相比增加到了兩倍(約5克),同時柔性光纖的重量和易彎曲程度沒有改善,配戴此顯微鏡的小鼠在較大活動範圍和較長記錄時程下的活動仍然存在一定的限制。

2022年3月18日,挪威科技大學 Edvard I. MoserWeijian ZongCell 上發表了文章Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice。本文作者在這些設計的基礎上研發了新一代的微型化雙光子顯微鏡,命名為MINI2P。MINI2P可以實現快速、高解析度的多層同時成像,在小鼠自由活動狀態下單次記錄的神經元數量首次超過1,000個(見原為圖3F,以及補充視訊Video2)。

神經元記錄數量的突破得益於改進的微型光學系統 (原文圖2Ai) 以及新研發的微型變焦透鏡(µTLENS,原文圖2Aii-iii)。新的變焦透鏡體積更小、重量更輕、變焦範圍更大,同時沒有明顯熱效應和焦平面漂移(原文補充方法section 4)。利用新的變焦元件,小鼠自由活動下高速、長時程的多層成像以及三維神經功能成像得以有效實現(原文補充video2)。更為重要的是,本文作者系統地研究了探頭重量以及連接光纖的柔性程度這兩項指標對小鼠行為的影響(原文圖1和補充材料圖1)。

MINI2P探頭總重量小於3克(探頭自重2.4克,固定元件重0.5- 0.6克),並搭配了新設計的拉錐柔性光纖束(tapered fiber bundle,見原文圖2Aiv),這使得MINI2P可以被應用於多種不同的行為學正規化而不會對小鼠產生可觀測到的行為學影響(曠場自由探索:原文圖1-圖5,補充視訊videos 1-4;攀爬梯子並從高臺跳躍:原文圖6A-6E,補充視訊videos 6 part I; 接受危險信號後的逃跑行為:原文圖6F-6M,補充視訊videos 6 part I)。

此外,本文還提出了一種視場拼接的方法(FOV stitching): 通過對MINI2P成像畸變的矯正、鄰近視場的配准以及被重複記錄的神經元的檢測和去除,25個不同的成像視場可以被拼接在一起,以覆蓋2.2毫米x2.2 毫米x2 層的視野範圍(原文圖3H)。在這樣的視野範圍內,超過1萬個神經元的信號可以被記錄和分析(原文補充video3)。MINI2P使用了3款可以隨意更換的微型物鏡,分別可以對視覺皮層(V1)等位於大腦頂部的區域、內嗅皮層(MEC)等位於大腦中-外側的區域以及海馬區(CA1)等位於大腦深層的區域進行高分辨成像(原文圖2v,以及補充video 1)。

為了驗證MINI2P的可靠性,本文作者在曠場實驗(open-field task)中分別在視覺皮層(原文圖4)記錄到了幾百個方位細胞(place-modulated cells)和頭部方向細胞(head direction-modulated cells), 在內嗅皮層記錄到幾百個網格細胞(grid cells)(原文圖5,補充video5),以及在海馬區記錄到了幾百個方位細胞(place-modulated cells)。在小鼠攀爬梯子並從高臺跳躍(ladder-climbing task)的實驗中, 本文作者對內嗅皮層進行穩定的高解析度成像(原文圖6A-6E),並採集到了分別定位於攀爬過程、平臺頂部和跳躍過程之中活躍的神經元(原文圖6E)。

在小鼠逃跑行為(escape assay)中,本文作者採集到了幾十個與逃跑行為具有相關性的神經元活動(原文圖6L-6M)。最後,本文作者討論了現有技術存在的侷限性,例如:成像深度較臺式雙光子顯微鏡相比仍有差距,成像速度以及視場在現有技術下提升空間有限,小鼠的行為學範圍仍受到連接線纜的限制(目前限於1米x1米的區域內)等。針對這些侷限,作者提出了相應的解決方案及該技術今後的發展方向。

最後,MINI2P所有的設計資料以及分析軟體現均已開源分享(連結見原文)。所有成像原始資料(2.8TB)也已上傳並可以自由下載(連結見原文)。

本文作者還特別製作了顯微鏡搭建和測試的教學視訊(https://www.youtube.com/watch?v=HjAtoPbDu8E;https://www.youtube.com/watch?v=I0aYfi8GrIc)以方便研究者自行搭建MINI2P並使用MINI2P技術開展研究。

原文連結:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.02.017

注:本篇報道版權歸作者所有,brainnews僅分享。

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