Cell | 基於成像的CRISPR篩選繪製人必需基因的表型圖譜

撰文 | 亦

解析必需基因在不同細胞過程中的作用是理解細胞生長、增殖和生物學功能所必需的。近日,來自懷特黑德生物醫學研究所的Iain M. Cheeseman和來自麻省理工學院博德研究所的Paul C. Blainey團隊合作,共同在Cell上發表了Resource文章The phenotypic landscape of essential human genes。研究將CRISPR-Cas9為基礎的功能篩選和顯微鏡成像結合,鑑定了5,072適應性基因中,超過90%基因敲除的顯著表型,提示其在特定生物學過程中發揮作用,揭示基因間的關聯,提供了人基礎基因的功能全景。

基於CRISPR-Cas9的混合基因篩選能夠干擾成千上萬個遺傳因子,革新了我們測試細胞增殖和存活需求對應功能的能力【1】。目前大多數的篩選方法基於熒光激活的細胞分選(FACS)【2,3】,它總結了每個擾動在群體水平上對細胞表型的貢獻,而定義必需基因的特異貢獻需要對複雜的細胞表型進行定量分析。近期的研究將混合功能遺傳篩選和單細胞轉錄本丰度分析結合【4-6】,但對應核心細胞功能的很多表型,如亞細胞定位,需要顯微鏡進行直接的具象化,陣列篩選一定程度上解決了這一點,但是很難規模化【7】。為此,最近的混合篩選方法利用原位擾動基因分型【8】或基於圖像表型物理篩選細胞【9】,但這一富集方法針對預先定義的表型,不能對做深度的關聯探索。通過成千上萬的基因組擾動,查詢和系統比較大量和多樣化的細胞生物學表型,特別是形態學和空間組織能力,是功能研究一個重要的未實現的目標。

為解決以上問題,作者首先基於多輪Cas9和轉座子遺傳篩選,定義了5,072個適應性基因和一個包含20,445個sgRNAs的文庫。將此文庫遞送至含有Cas9的HeLa細胞,78h後固定細胞進行原位sgRNA序列放大,DAPI、DNA損傷應答、微管和絲狀肌動蛋白染色成像,原位測序,作者從每個單獨的細胞圖像中得到1,084個表型參數,基於此作者將其分為間期或有絲分裂期並進行下游分析。這一方法產生了31,884,270個單細胞的顯微圖像,其表型都與sgRNA相對應,每組四種sgRNAs的每個基因靶細胞中位數為6,119個細胞。

為了識別維持基因組完整性所必需的基因,作者分析了間期核參數的表型評分,觀察到DNA損傷(平均γH2AX核強度)和DNA含量(整合DAPI核強度)之間存在明顯的相關性。接下來,作者想要識別發揮細胞骨架功能的基因,他們發現破壞肌動蛋白的骨架,黏附分子或整合素亞單元都會擾亂細胞黏連和改變細胞形態。與之前研究不同,KCTD10在調節肌動蛋白裝配上一直起作用,而不僅限於細胞遷移或發育程式設計的細胞融合時。此外,作者也發現了調節間期微管蛋白水平的多個因素。除染色參數外,作者還分析了細胞核和細胞區域的形態學參數,他們注意到靶向翻譯相關基因導致細胞面積減少,而靶向DNA複製修復相關基因導致細胞面積增加。類似地,細胞核大小也存在顯著差異。

基於成像資料總結的表型得分,作者創建了每個基因的表型概況,識別出了具有相似間期表型的基因和一些功能亞單元基因,比如翻譯相關會分9群,不同類群基因的敲除都會導致細胞核和細胞面積的減少,但其它表型參數會不同。意外地是,儘管沒有針對細胞器的膜進行染色標記,作者仍發現了與囊泡運輸相關的基因,說明間接的作用也能被篩選到。

至此,作者一共識別出4,665個展現可測量間期表型的基因。通過正交方法驗證以及與之前註釋比較,研究提供了一個特定蛋白質對核心細胞過程不同功能貢獻的更為精細的圖像,其可以應用於基因功能和途徑關聯的探究,識別關鍵生物學過程中共同作用的因子,包括之前刻畫很少的基因,如C7orf26。

對於2.6%被劃分為有絲分裂期的細胞,作者做了類似分析,識別了大量有絲分裂功能相關的基因類群,可以區分類群和單個基因的特異作用,發現了799個在MitoCheck資料中不存在的新基因,比如ZNF335促進紡錘體功能,在中心體功能中也發揮間接作用,這說明新的方法在靈敏度和有效性上都有了很大提升。

隨後,作者進行了二次混合活細胞篩選,選取了228個認為與有絲分裂表型無關的基因和11個陽性對照,其中197個基因呈現出有絲分裂持續時間的改變,進一步驗證了在固定細胞分析中識別不同有絲分裂分子的能力。出乎意料的是,作者鑑定出兩種膜轉運結合蛋白AQP7和ATP1A1,單獨敲除其中任意一個都會導致染色體排列的延遲和有絲分裂持續時間的延長,但是在紡錘體或著絲粒裝配中沒有異常。PEG3000的加入發現AQP7和ATP1A1是創造內部滲透細胞環境所必需的,這一環境能促進染色體分離,揭示了滲透性及其調節在有絲分裂保真度上的作用。

進一步的研究發現有絲分裂表型的基礎是著絲粒的功能,其在細胞分裂過程中介導著絲粒DNA和微管聚合物之間的相互作用。敲除LIN52, CLP1和RNPC3會帶來關鍵有絲分裂分子產生的選擇性缺陷,從而導致染色體錯誤分離和著絲粒功能障礙。

綜合來看,

綜合來看,研究通過顯微鏡對數千萬個基因敲除細胞進行分析,發現了由此產生的細胞表型對核心生物過程的特定貢獻,構建了一個全面的基因型——表型資源庫,定義了大量未被闡釋的人類必需基因的功能。

原文連結:

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017

製版人:十一

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