導讀
CRISPR/Cas 系統為細菌提供了適應性免疫，同時其準確識別和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力也為植物、動物和微生物基因組編輯提供了強大的工具。目前，基於 CRISPR-Cas9 基因編輯的多項臨床實驗也已啟動並獲得突破性結果，為許多遺傳疾病的治療開闢了新的途徑。
德國馬克斯·普朗克病原學研究所的 Emmanuelle Charpentier 以及美國加州大學柏克萊分校的 Jennifer A. Doudna 也因為開發了這一最重要的基因組編輯方法而摘得 2020 年諾貝爾化學獎的桂冠。
近年來，CRISPR/Cas 相關的研究也取得巨大的進展，其中多項研究均發現了一個包含 RuvC 的 Cas 蛋白家族，被稱為 Cas12，其變體表現出不同的生化和細胞活性。
其中，Cas12c 最初發現於腸道宏基因組的小 DNA 片段中，雖然與其他 DNA 切割 Cas12 酶存在共同的特徵，但這種蛋白質的一些生化特性仍然是未知的：比如其 RNA 識別和加工的機制尚不清楚；此外，由於缺乏可檢測到的 DNA 酶活性，Cas12c 是否或如何為細菌提供抗病毒保護仍然是有待回答的問題。
2022 年 6 月 2 日，諾獎得主 Jennifer A. Doudna 及其團隊在 Molecular Cell 發表了題為 A naturally DNase-free CRISPR-Cas12c enzyme silences gene expression 的研究文章，發現 Cas12c 是一種 RNA 引導的 DNA 結合酶，它不切割靶 DNA，而是通過 crRNA 介導的相互作用與靶 DNA 結合，並可以通過識別噬菌體必需基因來保護細菌免受噬菌體的感染。
圖片來源：Molecular Cell
主要研究內容
Cas12c 可處理 pre-crRNA，但不切割 DNA
為了確認 Cas12c 是否具有發揮免疫保護功能的一系列酶活性，他們首先重組了 Cas12c 並對其進行了更詳細的探索。結果發現，不像其他 Cas 酶可以直接結合重複序列的近端或內部，Cas12c 切割蛋白結合重複序列下游 17 個核苷酸的 pre-crRNA。
接下來，他們藉助多種底物檢測了 Cas12c 切割 DNA/RNA 的能力，均發現 Cas12c 無法切割這些與導向 RNA 互補的底物。因此，這些結果表明 Cas12c 是 RNase（核糖核酸酶），而不是 DNase（脫氧核糖核酸酶），無法對 DNA 進行切割。
圖片來源：Molecular Cell
Cas12c RuvC 結構域負責 pre-crRNA 的處理
隨後，研究人員推測 Cas12c 的 RuvC 核酸酶結構域是執行 pre-crRNA 加工的部位。與該假說一致的是，當將 RuvC 金屬配位羧酸鹽突變後，Cas12c 的 pre-crRNA 處理活性隨即喪失。
為了驗證 RuvC 結構域在 pre-crRNA 加工中的作用，他們評估了 Cas12c 加工 pre-crRNA 後產生的 RNA 產物的性質，結果發現處理後的 RNA 切割片段的電泳遷移率降低，這與金屬離子依賴的催化機制一致，表明 Cas12c 的金屬離子依賴的 RuvC 結構域負責 pre-crRNA 的處理。不過，後續的更加深入的實驗結果也表明 RuvC 結構域在 Cas12c 中的作用也僅為 pre-crRNA 的處理。
圖片來源：Molecular Cell
RNA 引導的 Cas12c 與 DNA 結合依賴於 pre-crRNA 的加工
上述的實驗已經證明 Cas12c 不進行靶 DNA 切割，那麼 Cas12c 是否能結合經由 RNA 引導的互補底物？結合篩選實驗表明，Cas12c 在低奈米摩爾範圍內可結合目標 dsDNA，並對部分鹼基配對的 DNA 具有更強的親和力。因此，這些資料表明，像其他 Cas12 酶和 Cas9 一樣，Cas12c 也與目標 ssDNA 具有較高的結合親和力但不能檢測到與 ssRNA 結合。
圖片來源：Molecular Cell
Cas12c 的 pre-crRNA 加工活性提示 crRNA 成熟可能對目標 dsDNA 結合至關重要。為了證實這一想法，他們測試了在 pre-crRNA 或成熟 crRNA 的介導下，Cas12c 的 DNA 結合親和力。
結果發現，野生型 Cas12c 在每種情況下都能以相似的親和力與目標 dsDNA 結合；然而，當 pre-crRNA 含有阻止 Cas12c 催化過程的硫代鹽時，Cas12c 對 dsDNA 的結合作用有明顯的減弱。因此，這些結果表明，CRISPR-Cas12c 系統的功能需要 pre-crRNA 的處理，如果沒有 pre-crRNA 的處理，Cas12c 則無法有效地結合目標 dsDNA。
圖片來源：Molecular Cell
Cas12c 可以在不觸發 DNase 活性的情況下阻斷基因表達
前期的研究發現，Cas12c 可以靶向細菌中生存必需的基因，這可能是由於體內 Cas12c 介導的基因組靶點的切割，也可能是 Cas12c 通過靶向聚合酶阻斷反應來介導轉錄沉默。為了探索這些可能性，研究人員利用大腸桿菌開發了一種雙色熒光干擾試驗，其中編碼紅色熒光蛋白（RFP）或綠色熒光蛋白（GFP）的報告基因被整合到大腸桿菌基因組中。
Cas12c 定向切割導致的染色體斷裂對大腸桿菌是有毒的；相比之下，如果 Cas12c 結合但不切斷靶 DNA，則會觀察到基因靶向熒光團的損失而不導致細胞死亡。他們的實驗結果表明，野生型 Cas12c 和 RuvC 失活的 dCas12c 在靶向 GFP 或 RFP 的 sgRNA 的引導下，可以沉默基因表達而不殺死細胞。因此，這些結果也與上述生化資料一致，即 Cas12c 是結合但不切割目標 DNA。
圖片來源：Molecular Cell
天然 Cas12c 保護細胞免受噬菌體感染
在自然界中，CRISPR-Cas 系統被認為是通過 RNA 引導外源核酸的切割來保護原核生物免受病毒感染，而 dsDNase 活性是所有已知的 DNA 靶向 CRISPR 系統的關鍵功能。然而，Cas12c 沒有可檢測到的 DNase 活性，那麼其是否也能夠僅基於靶向 DNA 結合提供抗噬菌體免疫保護作用？
他們使用噬菌體空斑實驗來回答了這一問題。結果與預期一致，他們的確觀察到了野生型 Cas12c 具有獨立於 DNA 鏈靶向的抗噬菌體活性。
圖片來源：Molecular Cell
此外，與靶向非必需基因相比，Cas12c 與靶向噬菌體必需基因的 sgRNAs 配對，可以使斑塊減少幾千倍。有趣的是，RuvC 失活的 dCas12c 的結果與野生型 Cas12c 的結果類似，這表明噬菌體防禦是獨立於 RuvC 活性發生的。
圖片來源：Molecular Cell
結語
在微生物的進化中，CRISPR-Cas 酶通過降解外源核酸為微生物提供免疫，可以保護細菌免受病毒侵害。在這項研究中，Jennifer A. Doudna 團隊揭示 CRISPR-Cas12c 的一個重組 RuvC 結構域只切割 precrRNA，而不是目標 DNA，在不對入侵者進行化學攻擊的情況下完成抗病毒干擾。
此外，他們發現 Cas12c 的 RuvC 結構域只催化 pre-crRNA 的成熟，以介導 Cas12c 與靶向 DNA 結合進而發揮轉錄抑制的作用。同時，這種天然的不含 DNase 的 Cas12c 酶可以在針對噬菌體必需基因時保護細菌免受噬菌體感染。
總之，這些結果表明，即使在不具有 DNA 切割活性的情況下，CRISPR 系統也可以提供抗噬菌體免疫保護功能。
圖片來源：Molecular Cell
參考文獻
1. Huang et al., A naturally DNase-free CRISPR-Cas12c enzyme silences gene expression, Molecular Cell (2022).
2. Knott, G.J., and Doudna, J.A. (2018). CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science 361, 866–869.
3. Nussenzweig, P.M., and Marraffini, L.A. (2020). Molecular mechanisms of CRISPR-Cas immunity in bacteria. Annu. Rev. Genet. 54, 93–120.
