點評 | 孔祥峰（輝大基因）、楊輝（輝大基因、中科院腦智越創新中心）
CRISPR-Cas系統是原核生物抵禦病毒的一種獲得性免疫系統。目前基於CRISPR-Cas的基因編輯技術已廣泛應用於基因校正，遺傳育種、新藥開發、動物模型構建、轉錄調控以及分子診斷等各領域。被譽為在後基因組時代開創了遺傳疾病精準治療的新時代。
CRISPR-Cas系統可以按照效應物是多亞基或單亞基分為Class I和Class II兩大家族（一型和二型）。單亞基效應物的Class II家族熟知的蛋白包括大家常用的Cas9, Cas12, Cas13等。Class I家族包括Cascade-Cas3, Csm, Cmr複合物等等。但是這些系統不管是哪類，都是sgRNA靶向和激活的核酸酶，對靶向的DNA或RNA進行切割。目前大家所使用的CRISPR-Cas技術都是圍繞sgRNA靶向和RNA guided核酸酶展開的。
2022年8月25日，康奈爾大學的可愛龍實驗室聯合荷蘭荷蘭代爾夫特理工大學Stan J.J Brouns實驗室在Science雜誌以長文形式發表了題為Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA activated protease的工作，全面解析了一種全新的CRISPR偶聯的蛋白酶新系統（Craspase, CRISPR associated Caspase）的工作機制。簡言之，這是一個gRNA引導的並且受到靶向RNA激活的蛋白酶系統，該蛋白酶受到激活之後可以對天然的蛋白底物以及工程化的多肽片段進行特異切割，展現出巨大的應用潛力。
CRISPR-Cas系統分為兩大家族Class I和Class II。Class I又可以細分為Type I, III, IV三大類，均為多亞基效應物系統【1, 2】。近些年，研究人員從type III家族內追蹤出一種全新的比較數量小眾的系統命名為type III-E系統。該系統有著三大特別突出的特性：第一，該系統雖然出自多亞基的type III系統，但是其所有的亞基卻全部以融合蛋白的方式串聯成一個巨大的單亞基（1300-1900個氨基酸），並命名為gRAMP (Giant Repeat Associated Mysterious Protein，重複序列相關的巨大的神奇蛋白)；第二，gRAMP蛋白是引導RNA介導靶向RNA的CRISPR-Cas系統，其擁有兩個RNase切割位點，可以對靶向的RNA切割成三段；第三，該CRISPR系統附近有一個命名為TPR-CHAT的蛋白酶，該蛋白酶CHAT和真核生物焦亡激活酶Caspase有著高度同源性，並且該蛋白酶已經被證實和gRAMP能相互作用形成複合物(1)。就單單這幾個特性，足夠使該系統展現出特別的吸引力。首先多亞基串聯成單個亞基，在表達和組裝上會更加高效，有潛力體現單亞基系統（比如Cas9）遞送優勢；另外該系統已經被證實在靶向RNA之後沒有旁切活性，使其在細胞內的毒性大大降低，未來有巨大的潛力，與Cas13一起成為RNA編輯器的承擔者；最後，該系統有著天然偶聯的蛋白酶系統，如果被證明其具體受到CRISPR-Cas系統調控的蛋白酶活性，未來就有可能開發出眾多的和蛋白定向降解的新工具，前景十分巨大。然後該系統的RNA靶向和目標RNA是否能激活蛋白酶，蛋白酶的底物是什麼等問題還是完全未知的，因此亟待其全面機制的解析（圖1）。
圖1：Type III-E CRISPR-蛋白酶偶聯繫統Craspase。A.系統進化樹分類，typeIII-E來源於一支小眾的進化方向；B上：CRISPR-Cas系統gRAMP和Caspase蛋白酶基因座。下：Craspase猜想的工作模型，gRAMP靶向RNA之後激活Craspase-like蛋白酶TPR-CHAT，使其切割蛋白底物，最終誘導細胞死亡。
該項工作由美國康奈爾大學可愛龍實驗室的胡純一博士領銜，首先通過冷凍電鏡對gRAMP多重功能狀態的捕捉，發現了gRAMP的一段loop序列，命名為gating loop（門控環，377-412位氨基酸序列）對靶向RNA的序列篩選具有check point的功能。具體講就是目標RNA的靶向是從guide RNA的3’→ 5’方向進行互補配對，門控環會對最後seed區(guide RNA的第1-4位鹼基)的鹼基互補序列進行「檢驗」，如果靶向的RNA與最後seed區是互補配對的，那麼門控環允許其通過大門，形成guide RNA-target RNA完全互補配對的雙鏈結構，只有形成該結構，才會激活gRAMP的兩個RNase酶切位點,進行切割。這項發現合理解釋了gRAMP通過門控環，對「最後一里路」的seed區互補配對進行檢測，以此來規避脫靶的機制（如圖2）。
圖2：Type III-E CRISPR-蛋白酶偶聯繫統中gRAMP避免脫靶的機制。A.不同狀態結構的比較。左：靜息狀態下門控環處於關閉狀態阻擋seed區鹼基配對；中：正確的目標RNA結合之後門控環開發；右：結構疊加。B. gRAMP靶向RNA以及切割的機制模式圖。目標RNA的靶向配對從guide RNA的3’開始進行，門控環對最後四個鹼基的配對進行 「檢測」 ，若全部互補配對，則會打開門控，完成全部的互補配對，最終實現RNA切割。
這個系統最重要的問題是，gRAMP靶向RNA之後，能不能激活蛋白酶？換言之，這個蛋白酶真的能像設想的那樣受到CRISPR-Cas系統的調控並被靶向的RNA激活碼？懷著這個終極問題，胡純一博士再對Craspase靜息，靶向「自我」RNA（Matching PFS target），靶向「非我」RNA（Non-matching PFS target）三種不同狀態進行了高分辨的結構重構。比較驚喜的發現，在Craspase靜息狀態和靶向「自我」RNA時，其蛋白酶TPR-CHAT並未發生構象改變，而當Craspase靶向了「非我」序列的RNA時，這種帶有特殊「標記」的RNA（guide序列自我的兩個鹼基不能互補，non protospacer flanking sequence (PFS) matching）會與蛋白酶亞基上的一段「開關螺旋」（switch helix）產生一個空間衝突，迫使開關螺旋進行結構重排併發生巨大的構象改變（圖3）。
圖3：Craspase靜息和靶向不同RNA的結構圖。A.不同狀態的冷凍電鏡密度圖。左：靜息Craspase；中：Craspase靶向「自我」序列RNA（matching PFS target）；右：Craspase靶向「非我」序列RNA (non-matching PFS target)。B. Craspase蛋白酶 「開關螺旋」 在以上三種狀態下的構象展示。
通過原子解析度的結構比較，團隊發現和靜息狀態比，靶向「非我」RNA之後，蛋白酶「開關螺旋」的重排和構象改變，會進一步推動蛋白酶活性口袋的結構變化，導致催化二聯體組氨酸-半胱氨酸的距離從6.6埃縮小到3.3埃，達到蛋白酶激活狀態（如圖4和微視訊1）。
圖4：Craspase蛋白酶激活示意圖。左：靜息狀態下CHAT蛋白酶口袋組氨酸-半胱氨酸催化二聯體距離為6.6埃；中：Craspase靶向「自我」序列RNA（matching PFS target）時，CHAT蛋白酶組氨酸-半胱氨酸二聯體距離為5.2埃並且沒有口袋；右：Craspase靶向「非我」序列RNA (non-matching PFS target)時，CHAT蛋白酶組氨酸-半胱氨酸二聯體距離為3.3埃，併產生結合口袋，處於蛋白酶激活狀態。
微視訊1：Craspase蛋白酶激活時構象轉變過程模擬。
這些研究表明，該系統的蛋白酶活性調控十分嚴謹，需要同時滿足至少三個條件。第一，目標RNA必須和guide RNA的引導區完全互補配對（至少18個鹼基）。第二，guide RNA 5′ tag位置的PFS區的前兩位（-1和-2位置鹼基）必須與目標RNA錯配。與靶向互補配對。第三，靶向RNA的3’端除去前兩位不能錯配的鹼基之外還需要額外至少3個鹼基用來推動蛋白酶的開關螺旋進行重排變構，從而激活蛋白酶（圖5）。
最後一個問題，這個蛋白酶的底物是什麼？團隊通過體內體外篩選，成功找到該Craspase系統蛋白酶底物，名為Csx30。該Craspase系統在結合了「非我」RNA之後能快速特異性地對該蛋白底物進行切割，生產一大一小兩個亞基，而其他的「自我序列」，哪怕能與guide RNA進行互補配對也無法激活蛋白酶。因此這個結果從生化水平非常確切地驗證了該蛋白酶系統受到CRISPR系統的精準調控，最後成為靶向RNA激活的蛋白酶。此外，該團隊還從結構出發，設計出了一些多肽序列，在體外也能在靶向RNA激活的情況下實現蛋白酶的精準切割。這在一定程度上暗示了該系統非常有潛力成為蛋白定向降解的新工具（圖5），前景十分廣大。
圖5：Craspase蛋白酶激活並且切割蛋白底物。A. Craspase系統蛋白酶激活模式。需要同時至少滿足RNA靶向以及PFS區前兩位鹼基錯配。B. Craspase系統切割Csx30需要RNA激活。C. Craspase系統切割Csx30嚴格通過PFS區的檢測來區分自我和非我序列，避免脫靶切割。D.設計工程化多肽可被Craspase系統靶向切割。
值得一提的是，在8月18和8月22日，bioRxiv預印本網站上，分別上傳了日本東京大學Hiroshi Nishimasu、美國麻省理工大學Jonathan S. Gootenberg團隊合作題為RNA-triggered protein cleavage and cell death by the RNA-guided type III-E CRISPR-Cas nuclease-protease complex，以及北京化工大學馮越教授與清華大學楊茂君教授合作題為Structural and functional insights into the type III-E CRISPR-Cas immunity的兩篇論文（如下圖）。該兩篇論文闡述了與可愛龍、Stan J.J Brouns實驗室發表的這篇Science論文一致的觀點。分別在Desulfonema ishimotonii和Candidatus 「Scalindua brodae」（與本篇Science論文使用了同一物種）物種中都觀察到了一致的現象。在PFS non-matching的RNA靶向之後，都會激活Caspase-like蛋白酶並切割蛋白底物Csx30。並且這兩篇論文都同時明確證實了Csx30在受到Craspase蛋白酶切割之後會誘導細胞死亡。
總之，上述幾篇論文，都同時闡述了Craspase系統是guide RNA引導的，並且受到靶向RNA激活的蛋白酶系統，該蛋白激活之後會切割蛋白底物，誘導細胞死亡。在未來，若在蛋白酶特異性上展開拳腳，有望翻開蛋白定向降解的新篇章。
專家點評
孔祥峰（博後/研究員 輝大基因）、楊輝（輝大基因、中科院腦智越創新中心）
細菌的CRIPSR-Cas系統一般通過直接切割入侵遺傳物質（包括DNA和RNA）或者產生次級信號分子激活輔助核酸酶來發揮適應性免疫防禦功能。Type III CRISPR-Cas系統兼具上述兩種能力，是目前已知最為複雜精密的CRISPR-Cas系統【3】。Type III CRISPR-Cas系統通常有多個效應蛋白協同發揮RNA靶向及切割的功能。Makarova等在2019年通過計算分析首次報導了type III-E CRISPR-Cas系統，該系統由一個融合了4個Cas7結構域、1個Cas11結構域和BID結構域的單一效應蛋白（gRAMP）組成【4】。Gootenberg團隊和Brouns團隊2021年證明Type III-E CRISPR-Cas系統具備RNA靶向切割的功能(Science | 揭秘gRAMP CRISPR-Cas效應蛋白實現適應性免疫的新機制;Nature | 低毒性！無旁切活性的新型RNA編輯工具Cas7-11)，並且沒有RNA旁切效應（collateral RNA damage）【1,2】，是一個特異性很高的RNA編輯工具。同樣作為RNA靶向切割的CRISPR-Cas13系統，天然具備很強的RNA旁切效應，因此使其具有較高的細胞毒性而限制了Cas13系統的進一步應用，不過近期我們通過蛋白定向改造進化，很好地消除了Cas13系統的RNA旁切效應(NBT｜楊輝團隊開發出特異性更高安全性更好的高保真版Cas13系統)【7】。
Type III CRISPR-Cas基因座上除了CRISPR簇及效應蛋白外通常還有一些輔助蛋白（如能被次級信號分子cOA激活的非特異性核酸酶Csm6/Csx1）的表達用於下游信號的激活等。在大部分type III-E系統中都發現了TPR-CHAT。TPR-CHAT是一個N端包含TPR重複結構域的caspase類似蛋白酶，它能和gRAMP形成很穩定的複合體——Craspase。Kranzusch團隊2022年Science文章報導了細菌體內caspase類似蛋白酶激活gasdermin介導細胞程序性死亡（PCD）的機制，這和人類細胞內caspase-gasdermin介導的炎症信號傳導抵禦病原體和癌症的機制類似（Science | 細菌中Gasdermins蛋白揭開細胞死亡的進化起源）。這些發現暗示Craspase可能是細菌體內CRIPSR RNA引導的蛋白酶，介導一種之前未被報導的「棄車保帥」自殺機制用於幫助抵禦細菌噬菌體的侵染。但是，Craspase的具體功能及其機制還不是很清楚，需要有高解析度的結構生物學證據來佐證。
可愛龍團隊和Brouns團隊合作首次報道了3.81埃靜息態、3.65埃PFS non-matching RNA結合態、3.76埃PFS matching RNA結合態以及3.62埃RNA切割後的高解析度gRAMP結構，此外他們還解析了Craspase的結構，得到了靜息態、PFS non-matching / matching RNA結合態的高解析度結構。該工作詳細闡明gRAMP的RNA靶向切割機制；確認Craspase是一個CRISPR RNA引導的蛋白酶系統，細菌體內Csx30是其天然的底物；通過高解析度結構解析發現Craspase的蛋白酶活性受到嚴格調控：當Craspase靶向PFS non-matching RNA（即外源入侵RNA）時蛋白構象發生改變，激活蛋白酶活性，該蛋白酶活性又再靶向RNA切割完成後被關閉，從而實現對蛋白酶活性的嚴格調控。
總之，該工作詳述了gRAMP和Craspase的作用機制，為後續gRAMP介導的RNA編輯工具及Craspase介導的可調控、選擇性激活的蛋白酶系統的開發及最佳化提供了分子水平的理論依據。期待後續工作檢測Craspase在真核生物系統尤其是哺乳動物細胞內的活性，探究其用於幫助抵禦病原體侵染或者輔助癌症治療的可能性。
原文連結：
http://doi.org/10.1126/science.add5064
製版人：十一
參考文獻
1. van Beljouw, S.P.B., Haagsma, A.C., Rodriguez-Molina, A., van den Berg, D.F., Vink, J.N.A. and Brouns, S.J.J. (2021) The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase.Science, 373, 1349-1353.
2. Ozcan, A., Krajeski, R., Ioannidi, E., Lee, B., Gardner, A., Makarova, K.S., Koonin, E.V., Abudayyeh, O.O. and Gootenberg, J.S. (2021) Programmable RNA targeting with the single-protein CRISPR effector Cas7-11.Nature, 597, 720-725.
3. Molina, R., Sofos, N. & Montoya, G. Structural basis of CRISPR-Cas Type III prokaryotic defence systems.Curr Opin Struct Biol65, 119-129 (2020).
4. Makarova, K.S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants.Nat Rev Microbiol18, 67-83 (2020).
5. Tong, H. et al. High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects.Nat Biotechnol(2022).
